疟疾作为全球重大传染病，其传播效率高度依赖按蚊（Anopheles）的夜间吸血行为。然而，按蚊唾液腺的昼夜节律调控及其对疟原虫（Plasmodium）孢子体（sporozoite）生物学的影响长期未知。传统观点认为唾液腺内孢子体处于转录静默状态，但这一假设缺乏高时间分辨率数据的支持。此外，疟原虫在哺乳动物血液阶段已证实存在昼夜节律，但孢子体阶段的生物钟调控机制及其与媒介、宿主的协同关系仍是空白。

为解决这些问题，来自美国加州大学伯克利分校和葡萄牙分子医学研究所的研究团队通过多组学联合分析，揭示了按蚊-疟原虫-宿主三方生物钟的协同作用。研究首先采集感染疟原虫的斯氏按蚊（A. stephensi）唾液腺样本，在12小时光/暗（LD）和持续黑暗（DD）条件下，每4小时进行转录组测序（RNA-seq）和质谱分析（LC-MS/MS）。关键实验还包括：1）通过EdU标记和转基因寄生虫系（P. berghei-GFP-TK）验证孢子体无DNA复制；2）量化蚊虫昼夜吸血量差异（血红蛋白测定）；3）时序匹配的肝细胞感染实验（Hepa1-6细胞系）。

研究结果分为三部分：

1. 按蚊唾液腺的昼夜调控网络
   发现27-49%的唾液腺基因呈节律性表达，峰值集中于光照开始后4小时（ZT4）和黑暗开始后4小时（ZT16）。关键功能基因包括：

• 抗凝血相关：过氧化物酶5B（Peroxidase 5B）、D7L2蛋白、anophelin/cEF

• 感染促进因子：SG1家族（TRIO、Saglin）、γ-干扰素诱导溶酶体硫醇还原酶（GILT）
  蛋白质组学证实113种蛋白（如糖酵解途径的丙酮酸脱氢酶E1α/E1β）存在昼夜波动。

2. 孢子体的转录活性与节律性
   颠覆传统认知，发现12-20%的孢子体基因（如运动相关myosin A、TRSP、AMA1）呈现昼夜振荡。单细胞分析排除了细胞周期干扰（EdU阴性），且相位与唾液腺节律同步。

3. 时间依赖的传播效率
   行为实验显示蚊虫夜间（ZT16）吸血成功率提高2.3倍，血红蛋白摄入量增加76%。时序匹配的小鼠感染实验表明，夜间孢子体（ZT16）的肝脏定殖效率显著高于日间（ZT4）（P=0.0024），而肝细胞生物钟同步化可进一步放大此差异（3.76倍）。

结论指出，疟原虫通过进化适应媒介与宿主的生物钟，形成“三重节律协同”机制：按蚊唾液腺节律优化吸血效率→孢子体节律性表达运动蛋白（如TRAP）→宿主肝细胞节律增强感染。这一发现为阻断传播链提供了新靶点（如TRIO抑制剂），并提示防控措施（如杀虫剂喷洒）需考虑时间窗口效应。研究框架还可拓展至登革热、寨卡等节律依赖性虫媒病。

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