### 研究背景
衰老与免疫功能下降密切相关，老年人对感染的易感性增加、疫苗接种需更高剂量、自身免疫疾病和癌症发病率上升。尽管有研究探索用雷帕霉素等抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mTORC1）信号来对抗免疫衰老，但有效逆转年龄相关免疫衰退的策略仍未满足需求。此前已有研究揭示了 T 细胞随年龄的一些变化，但缺乏全面、多时间点的研究。本研究旨在通过多组学单细胞测序技术，全面解析小鼠 T 细胞在衰老过程中的变化，寻找潜在治疗靶点。

实验设计

1. 实验动物及样本处理：选用野生型雄性 C57BL/6 小鼠，在无病原体条件下饲养。收集 10 个不同年龄组小鼠脾脏的 T 细胞用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），4 个年龄组小鼠脾脏的细胞核用于单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）。
2. 测序文库制备及测序：scRNA-seq 利用 10× Genomics 平台制备文库并在 Illumina NextSeq500 测序；T 细胞受体（TCR）α/β 文库用内部引物扩增后测序。scATAC-seq 按 10× Genomics 协议制备细胞核，用 NextGEM ATAC-seq v1.1 检测试剂盒处理并测序。
3. 实验验证：通过流式细胞术对实验结果进行验证，包括刺激纯化的脾脏 CD3⁺T 细胞、染色及细胞内标记，以及分离不同年龄小鼠的 CD8⁺T 细胞进行激活和细胞因子分析等。
4. 数据分析方法：scRNA-seq 数据用 Scanpy 进行质量控制、归一化、主成分分析聚类等；scATAC-seq 数据进行质量控制、聚类和注释等分析，还进行了基因活性评分、转录因子（TF）基序富集分析等。

实验结果

1. T 细胞群体的单细胞转录组分析
   • 细胞聚类及亚群鉴定：scRNA-seq 分析得到 20 个不同的 T 细胞簇，包括 11 个 CD8⁺T 细胞簇、7 个 CD4⁺T 细胞簇、1 个自然杀伤 T（NKT）细胞簇和 1 个 Gzmk⁺T 细胞簇。各簇具有独特的基因表达模式，如 CD8⁺T 细胞簇中的幼稚 / 干细胞簇表达幼稚标记基因，效应记忆簇表达相关功能基因等；CD4⁺T 细胞簇也有类似特征，且调节性 T 细胞（Treg）群体有不同的激活状态。
   • 年龄相关的 T 细胞亚群动态变化：将小鼠分为年轻、成熟和老年组，发现老年小鼠脾脏 T 细胞总储备减少，但 CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞和 B 细胞比例不变。老年小鼠中功能失调 / 效应记忆 T 细胞、Gzmk⁺细胞和激活的 Tregs 增加，幼稚 T 细胞减少。通过 Mann–Kendall 趋势检验量化各簇变化趋势，Gzmk⁺簇等显著增加，而 CD4⁺幼稚早期激活细胞等显著减少。
   
   
2. TCR 库多样性和克隆性随年龄变化
   • TCR 克隆大小和克隆性变化：随着小鼠年龄增长，TCR 克隆大小增加，尤其是在 CD4⁺激活的 Tregs、CD8⁺效应记忆 T 细胞（TEMs）和 CD8⁺Gzmk⁺群体中。用 Gini 系数评估克隆性发现，13 周时克隆性增加，成年后从 18 - 117 周总体呈上升趋势，特别是在 CD8⁺Gzmk⁺亚群中。
   • TCR 库分析：分析老年小鼠 TCR 库，确定了 10 个最扩展的 T 细胞克隆，这些克隆主要来自老年动物，且在个体小鼠间差异较大。
   
   
3. 衰老小鼠脾脏 T 细胞的表观基因组景观
   • 染色质可及性分析：scATAC-seq 分析发现，虽然 CD4⁺或 CD8⁺T 细胞的 ATAC-seq 谱在年龄组间无显著变化，但老年小鼠中 CD8⁺T 细胞略有减少，CD4⁺T 细胞增加。鉴定出 8 个不同染色质状态的 CD4⁺T 细胞簇和多个 CD8⁺T 细胞簇，各簇有独特的染色质可及性特征和基因活性模式。
   • 幼稚 CD4⁺T 细胞的发育轨迹分析：对幼稚 CD4⁺T 细胞进一步亚聚类，发现其包含三个离散群体，通过伪时间分析揭示了从幼稚到早期激活的分化轨迹，同时发现转录因子结合基序在不同阶段有显著变化。
   
   
4. 定义年龄相关的 CD4⁺和 CD8⁺Gzmk⁺T 细胞的转录和表观遗传程序
   • Gzmk⁺T 细胞的特征：scRNA-seq 分析显示，细胞毒性 Gzmk⁺CD4⁺和 Gzmk⁺CD8⁺T 细胞表达高水平的 Gzmk 及其他细胞溶解和促炎分子，两者都高表达 Nkg7。
   • 转录和表观遗传调控：细胞毒性 CD4⁺T 细胞发育受转录因子调控，Gzmk⁺CD4⁺和 CD8⁺T 细胞中 Eomes 和 Runx3 水平升高。scATAC-seq 数据显示 Eomes 启动子染色质可及性增加，且在这些细胞中 Eomes 结合位点基序富集。年龄相关基因在 Gzmk⁺T 细胞中显著富集于多个生物学通路，且呈现不同的表达模式。
   
   

讨论

1. 研究结果与前人研究的关系：本研究结果与之前报道的衰老过程中幼稚 T 细胞减少、记忆和效应 T 细胞增加的趋势一致，同时鉴定出更多独特的 T 细胞亚群，体现了研究方法的优势。
2. Gzmk⁺T 细胞的潜在作用及研究意义：Gzmk⁺T 细胞在老年小鼠中显著增加，可能导致免疫反应向促炎和低效方向转变，Gzmk⁺T 细胞和 Gzmk 本身可能是解决年龄相关免疫功能障碍的潜在靶点。
3. 年龄相关基因和炎症反应：研究发现老年 T 细胞群体中 ISG15 等基因上调，表明 IFN 信号增加，还有其他年龄相关基因激活 NF-κB 信号，进一步证明炎症信号增强。scATAC-seq 数据揭示染色质可及性变化，表明 T 细胞表型向促炎方向转变。
4. 未来研究方向：未来应研究这些发现是否能预测老年人的变化，以及针对相关通路在年龄相关免疫功能障碍中的作用进行探索。

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