《BMC Plant Biology》：Diurnal dynamics of different circadian transcription modules in Chinese pine needles and roots during dormancy induction
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为探究油松（Pinus tabuliformis Carr.）休眠诱导期针叶和根系昼夜转录组动态，研究人员运用 RNA 测序（RNAseq）和加权基因共表达网络分析（WGCNA）技术开展研究。结果发现针叶和根系存在节律振荡基因，且鉴定出关键调控因子。该研究为解析松树休眠分子机制提供新视角。
在广袤的森林中，树木为了适应季节变化，进化出了独特的休眠机制。尤其是在温带和寒温带地区，冬季休眠对于树木的生存至关重要。在北半球，针叶树的休眠主要由短日照和低温诱导。然而，尽管科学家们已经知道植物的生物钟在其生长发育过程中起着关键作用，比如调控开花时间、生长周期等，但对于针叶树休眠的分子机制，特别是在昼夜节律方面的研究还十分有限。以往研究虽揭示了一些相关基因的作用，像 TFL2 在针叶树芽形成和生长停止过程中的调控作用，但油松针叶和根系在休眠诱导期的昼夜转录组动态变化，以及相关的分子调控网络，仍笼罩在神秘的面纱之下。
为了揭开这些谜团，北京林业大学的研究人员开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《BMC Plant Biology》杂志上，为我们理解松树休眠的分子机制带来了新的曙光。
研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先是样本采集，他们从北京林业大学校内森林以及北京温泉苗圃采集油松样本，涵盖不同时间节点的针叶和根系。接着进行 RNA 提取和测序，从样本中提取总 RNA 并构建互补 DNA（cDNA）文库，在 Illumina HiSeq×Ten 平台测序。之后利用 DESeq2 R 包进行差异基因表达分析，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）整合差异表达基因构建共表达网络。
下面来看看具体的研究结果。
- PtTFL2 表达与休眠建立紧密相关：研究人员对 PtTFL2 基因进行了长期监测，发现其表达与油松的休眠建立密切相关。在每年 9 月下旬，随着光周期缩短和温度下降，PtTFL2 基因显著激活。在连续两年的观察中，其表达在 10 月 15 日左右达到峰值，随后下降，呈现出明显的季节性特征。在昼夜周期中，PtTFL2 基因白天先升高后降低，夜间表达较低，表现出一定的昼夜节律。这表明 PtTFL2 基因可能是调控油松休眠的关键因子，并且在秋季响应昼夜变化而被激活。
- 油松自然环境中转录组的昼夜动态变化：随着白昼时间缩短，油松进入休眠状态，针叶和根系都经历了显著的转录变化。研究发现，针叶和根系中分别有 2,579 和 2,107 个昼夜节律基因。通过主成分分析（PCA），样本被分为四组，分别是白天的针叶样本（ND）、夜间的针叶样本（NN）、白天的根系样本（RD）和夜间的根系样本（RN）。PC1 清晰地将针叶样本和根系样本区分开来，表明两者转录组存在显著差异，意味着它们在休眠过程中可能采用不同的转录机制。夜间针叶中差异表达基因（DEGs）的增加幅度高于白天，且随着温度下降，这些 DEGs 表达增加，其中许多是抗寒基因。而根系中 DEGs 数量在白天和夜间的变化相对较小，这可能与土壤的温度缓冲作用有关。
- 时钟相关基因转录的昼夜节律：研究人员进一步分析了与昼夜节律和光受体相关的基因，如 PtCCA1、PtPRR4、PtGI、PtTCP42 和 PtLOB94。结果发现，这些基因在针叶和根系中的转录表达模式均呈现出显著的振荡。例如，PtGI 在针叶中白天表达较低，夜间急剧上升；而在根系中则相反，白天表达较高，夜间急剧下降。不同月份的分析显示，除 12 月 25 日外，PtTCP42 和 PtLOB94 在其他时间点都表现出显著的昼夜节律；PtCCA1、PtPRR4 和 PtGI 在所有六个时间点都有显著的昼夜节律，但 12 月 25 日的表达模式有所不同，可能受低温影响。这些结果表明，这些基因在调节油松生物钟方面发挥着重要作用。
- 针叶和根系对休眠的响应特征：通过对昼夜节律基因进行基因本体（GO）富集分析，研究人员发现针叶和根系中大部分昼夜节律基因是共享的，但针叶中的富集类别更多。与溶质和离子跨膜运输相关的基因在两者中都很丰富，这表明调节跨膜运输是对冷应激的重要响应。此外，针叶在夜间对寒冷的响应更强，涉及更多与昼夜节律和核酸结合转录因子活性相关的基因。而根系中响应昼夜节律的基因在白天表达较高，且这些基因在多个生物学过程中富集，表明根系在响应压力和环境刺激方面发挥着重要作用。利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析发现，针叶和根系在运输、分解代谢、植物激素信号转导等途径中都有相关基因参与，其中一些与生长激素相关的基因在夜间针叶中表达增加，可能与油松休眠有关。
- WGCNA 分析确定共表达模块与昼夜动态的关联：研究人员运用 WGCNA 对差异表达基因进行分析，在针叶和根系中分别鉴定出多个模块。其中，棕色模块在针叶和根系中都包含较多的转录因子和核心时钟基因。针叶和根系的棕色模块中有 35 个相同基因和 12 个相同转录因子，但两者在转录调控上存在差异，这表明针叶和根系在休眠过程中具有不同的转录控制机制。
综合上述研究结果，研究人员得出结论：确定了油松秋季休眠开始的关键时间节点，发现针叶和根系都存在节律振荡基因，尽管根系无法直接接收光信号。通过 WGCNA 分析，整合了不同时间点针叶和根系的差异表达基因，构建了共表达网络，鉴定出关键转录因子。这些发现为理解松树休眠的分子调控机制提供了新的视角，有助于进一步解析针叶树在休眠过程中对环境变化的适应策略。在讨论部分，研究人员指出，冬季休眠对木本植物至关重要，该研究深入分析了油松休眠诱导期的关键调控因子和信号通路，揭示了光信号和脱落酸（ABA）信号通路的相互作用，以及它们在调节冷适应和休眠中的作用。此外，研究还发现了参与冷响应的关键转录因子，如 AP2/ERF、MYB、NAC 和 Dof 家族成员，丰富了人们对植物适应低温环境策略的理解。然而，目前研究存在一定局限性，由于缺乏合适的针叶树遗传转化工具，无法直接在针叶树系统中验证研究结果。未来可利用转基因和基因编辑技术，进行定向育种，培育抗寒树木，增强树木的生态适应性，助力林业应对气候变化挑战。这项研究不仅深化了对植物休眠和应激反应机制的认识，还为未来的基因工程和林业生产提供了有价值的理论基础和实践指导。
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