实验方法

1. 细菌菌株与培养条件：选用 ST、SE 以及多种益生菌菌株，如嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）、鼠李糖乳杆菌 GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG，LGG）等，分别在特定培养基和条件下培养。ST 和 SE 在 LB 肉汤中 37℃振荡培养，益生菌根据种类在 MRS 培养基中厌氧或在 LB 肉汤中需氧培养。
2. 体外实验
   • 琼脂孔扩散实验：将过夜培养的益生菌菌液加入接种有 ST 或 SE 的琼脂平板孔中，测量 12h 和 24h 后的抑菌圈大小，评估益生菌全菌培养物的抗沙门氏菌能力，并检测热处理对其抑菌效果的影响。
   • 共培养实验：将益生菌与沙门氏菌按一定比例在共培养培养基中厌氧培养 24h，在不同时间点取样计数，同时测量共培养体系的 pH 值，探究益生菌对沙门氏菌生长的抑制作用。
   • Trans - well 迁移实验：通过 Trans - well 实验，将 LGG 和 Bb12 置于滤膜上方，沙门氏菌置于下方，检测益生菌分泌产物的抗菌活性。
   • 细胞游离上清液（CFS）相关实验：制备 LGG 和 Bb12 的 CFS，通过琼脂孔扩散实验评估其对沙门氏菌的抑制活性，以及温度和蛋白酶 K 处理对该活性的影响。使用 3kDa 超滤离心管对 CFS 进行分级，验证低分子量产物的抑菌作用。
   • 细胞侵袭实验：利用极化的人结肠直肠腺癌细胞（HT - 29），用不同浓度的 LA、LGG 和 Bb12 的 CFS 预处理细胞，再感染沙门氏菌，评估 CFS 对沙门氏菌侵袭细胞能力的影响。
   
   
3. 体内实验
   • 鸡实验 1：选用 51 日龄无特定病原体（SPF）来航鸡，分为 5 组，分别为未感染未处理组（NC）、感染 ST 并使用 LGG 处理组（LS）、感染 ST 并使用 Bb12 处理组（BS）、感染 ST 并使用 LGG 和 Bb12 混合处理组（LB_S）、感染 ST 未处理组（PC）。从第 1 天到第 16 天，通过口服灌胃给予益生菌，第 7 天感染 ST，第 17 天处死鸡，检测各组织中 ST 载量。
   • 鸡实验 2：60 日龄 SPF 蛋鸡分为 4 组，实验流程与鸡实验 1 类似，但 LGG 通过饮水给药，从第 1 天持续到第 13 天，第 7 天感染 ST，第 15 天检测各组织中 ST 载量。
   • 鸡实验 3：400 只 1 日龄 SPF 来航鸡分为 5 组，包括 NC、未感染但使用 LGG 处理组（LGG）、感染 ST 并使用 LGG 处理组（LS）、感染 ST 并使用商业益生菌处理组（CS）、感染 ST 未处理组（PC）。从第 1 天到第 13 天，通过饮水给予 LGG 或商业益生菌，第 7 天感染 ST，在第 7 天和第 14 天进行剖检，检测各组织中 ST 载量、肠道菌群、肠道组织形态学变化以及免疫相关基因表达。
   
   
4. 分析方法
   • 肠道菌群分析：提取鸡实验 3 中盲肠组织 DNA，对 16S rRNA 基因的 V4/V5 区域进行 PCR 扩增、文库构建和测序。利用相关软件对测序数据进行质量评估、引物去除、ASV（扩增子序列变异体）推断、分类学注释等分析，计算 α 多样性和 β 多样性，并进行差异丰度分析。
   • LGG 特异性 PCR：对鸡实验 3 中检测到 LGG 的样本进行 LGG 特异性 PCR 验证，以确认肠道菌群分析结果。
   • 肠道组织形态学分析：收集鸡实验 3 中回肠和空肠组织，进行固定、脱水、包埋、切片和染色，测量绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD），并计算 VH/CD 比值，评估肠道完整性。
   • 免疫相关基因表达分析：提取鸡实验 3 中盲肠扁桃体的总 RNA，反转录为 cDNA 后进行实时定量 PCR（qRT - PCR），检测多种免疫相关细胞因子和趋化因子的基因表达变化。
   • 有机酸定量分析：采用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）结合同位素标记化学衍生法，对益生菌产生的有机酸进行定量分析。
   • 生物活性抗菌肽鉴定：利用 LC - MS/MS 对 LGG 和 Bb12 的上清液进行分析，鉴定其中的生物活性抗菌肽，并合成部分肽段测试其对沙门氏菌的抑制能力。
   • LGG 对多种沙门氏菌血清型的作用：通过琼脂孔扩散实验，检测 LGG 对多种常见沙门氏菌血清型的抑制效果。
   • 统计分析：使用 R 和 GraphPad PRISM 软件进行统计分析，不同实验采用相应的统计方法，以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。
   
   

实验结果

1. 体外实验结果
   • 琼脂孔扩散实验：LGG、Bb12 和 LA 的全菌培养物对 ST 和 SE 均有抑制作用，LGG 和 Bb12 在 24h 对 ST 的抑菌圈分别为 14mm 和 14.5mm，对 SE 的抑菌圈分别为 11.5mm 和 14.5mm。热处理未改变 LA、LGG 和 BB12 的抗沙门氏菌特性，Lbrev 在 4℃处理 12h 时对 ST 和 SE 有抑制作用，但 24h 时抑制作用消失，121℃处理后无抑制作用，EcN 对 ST 和 SE 无抑制作用，因此后续未对其进行进一步分析。
   • 共培养实验：LA 在共培养 6h 时开始显著抑制 ST 和 SE 生长，LGG 和 Bb12 在 12h 时对 ST 和 SE 的抑制作用明显增强，24h 时 LGG 和 Bb12 可完全清除 ST 和 SE。Lbrev 对 ST 无明显抑制作用，对 SE 仅在 6h 时有显著抑制作用。共培养体系的 pH 值随时间降低，但 Lbrev 共培养体系虽呈酸性却未抑制沙门氏菌生长，表明 pH 不是抑制沙门氏菌的唯一因素。
   • Trans - well 迁移实验：LGG 和 Bb12 的分泌产物在 Trans - well 实验中对 ST 和 SE 有显著抑制作用，12h 时 LGG 和 Bb12 的分泌产物分别使 ST 减少 2.45log 和 2.79log，24h 时 LGG 使 ST 减少约 3.3log，Bb12 使 ST 检测不到，对 SE 也有明显抑制作用，24h 时两者均使 SE 减少约 3log。
   • CFS 相关实验：LGG 和 Bb12 的 CFS 在琼脂孔扩散实验中对 ST 和 SE 有抑制作用，且抑菌活性具有热稳定性和蛋白酶抗性，经 3kDa 超滤离心管处理后的低分子量产物仍有抑菌作用。
   • 细胞侵袭实验：LA、LGG 和 Bb12 的 CFS 能显著减少沙门氏菌对 HT - 29 细胞的侵袭，25% 的 CFS 对感染 ST 的细胞效果最佳，12.5% 的 CFS 对感染 SE 的细胞效果最佳。
   
   
2. 体内实验结果
   • 鸡实验 1：口服给予 LGG 显著降低了感染 ST 鸡盲肠中的 ST 载量，10dpi 时降低约 1.9log，同时使脾脏中 ST 阳性鸡的比例降低 30%。但 Bb12 和 LGG 与 Bb12 混合处理组未降低盲肠中 ST 载量，且各处理组均未降低肝脏中 ST 载量，益生菌处理对鸡体重无影响。
   • 鸡实验 2：通过饮水给予 LGG 同样显著降低了感染 ST 鸡盲肠中的 ST 载量，8dpi 时降低约 1.91log，在脾脏和肝脏中的 ST 定植情况不一致，LGG 处理对鸡体重无影响。
   • 鸡实验 3：在模拟野外条件下，对饲养在垫料地面的鸡通过饮水给予 LGG，显著降低了 7dpi 和 14dpi 时盲肠、肝脏和脾脏中的 ST 载量。7dpi 时，PC 组、LS 组和 CS 组盲肠中 ST 载量分别为 7.59log、1.64log 和 1.48log；14dpi 时，分别为 6.03log、2.29log 和 2.54log。同时，该实验中不同组鸡的体重出现显著差异，PC 组平均体重最低。
   
   
3. 机制研究结果
   • 肠道菌群调节：LGG 处理显著增加了 14dpi 时鸡盲肠菌群的 α 多样性，Chao1、Observed 和 Shannon 指数显著升高。在门水平，Firmicutes、Proteobacteria 和 Actinobacteria 是主要菌群，CS 组中 Proteobacteria 相对丰度显著低于其他组。在属水平，LGG 处理增加了 Butyricicoccus、Erysipelatoclostridium、Flavonifractor 和 Bacillus 等有益菌属的相对丰度，减少了 Blautia、Shuttleworthia、Intestinimonas 和 Subdoligranulum 等菌属的相对丰度，且 Lacticaseibacillus 仅在 LGG 和 LS 组中检测到。
   • 肠道组织形态学改善：LGG 处理提高了感染 ST 鸡回肠的 VH 和 VH/CD 比值，14dpi 时，LGG 组回肠 VH 显著高于 PC 组，LS 组回肠 VH 和 VH/CD 比值也明显高于 PC 组，表明 LGG 可能改善肠道完整性或促进肠道营养吸收。而空肠在各处理组间的 VH、CD 和 VH/CD 比值无显著差异。
   • 免疫相关基因表达：qRT - PCR 结果显示，在鸡盲肠扁桃体中，各处理组在 7dpi 和 14dpi 时多种促炎细胞因子和趋化因子的相对表达量无显著差异。7dpi 时，CS 组中 IL - 10 表达量显著高于 PC 组，PC 组中 IL - 1β 表达量在 7dpi 时高于其他组，14dpi 时低于其他组。
   • 抗菌物质分析：LC - MS/MS 分析表明，乳酸是益生菌 CFS 中的主要有机酸，LGG 和 Bb12 中乳酸含量较高。同时，从 LGG 和 Bb12 的 CFS 中鉴定出多种小肽，合成的 5 种肽段对 ST 均有抑制作用，其中 PN - 2 抑制作用最强，可达 86%。
   • 对多种沙门氏菌血清型的抑制作用：LGG 对多种沙门氏菌血清型（如 S. Anatum、S. Albany 等）均有抑制作用，对 S. Muenchen 的抑制圈最大，为 17 ± 0.50mm。
   
   

研究结论

打赏

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