《Applied and Environmental Microbiology》：Specific nucleotide substitutions in the burst sequence enhance polyhedrin expression in alphabaculoviruses: improvement of baculovirus expression vectors
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杆状病毒表达载体系统（BEVS）广泛用于生产疫苗等。本文研究发现，α- 杆状病毒多角体蛋白（POLH）基因 “爆发序列” 富 A 区域特定核苷酸替换（如 TTT 突变）能显著提升 POLH 表达，为优化 BEVS 提供新思路，助力提高外源蛋白表达量。
### 研究背景
杆状病毒是昆虫病原 DNA 病毒，分为四个属，其中 α- 杆状病毒在感染周期中会产生两种类型的病毒粒子：包埋型病毒（ODV）和芽生型病毒（BV）。ODV 被包裹在包含体（OBs）中，OBs 的主要成分是多角体蛋白（POLH）。α- 杆状病毒在感染后期，能在宿主细胞中产生大量 OBs，这得益于多角体蛋白基因（polh）的高表达。
20 世纪 80 年代，基于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒（BmNPV）开发出了杆状病毒表达载体系统（BEVS），用于在培养细胞和昆虫幼虫中表达外源蛋白。polh 基因转录起始位点和起始密码子之间 50bp 的 “爆发序列”，对 polh 基因的转录爆发至关重要，但其中影响 polh 表达的关键核苷酸尚未完全明确。本研究聚焦于爆发序列中的富 A 区域，探究其在 polh 基因表达中的作用。
材料和方法
细胞系和病毒 ：使用 BmN-4 和 Sf-9 细胞系，分别由 Susumu Maeda 和 Ryoichi Sato 提供。BmNPV-abb 和 T3-WT 作为亲本病毒，重组病毒 Luc-SP（Luc-Bm）和 Luc-30 用于报告实验。通过噬斑测定法测定 BmNPV 滴度，通过半数组织培养感染剂量（TCID50 ）测定 AcMNPV 滴度，细胞感染复数（MOI）设为 5。重组病毒的构建 ：构建重组 BmNPVs 时，将 polh 或荧光素酶（luc）序列克隆到转移载体 pBm31 中，利用 KOD-Plus 诱变试剂盒进行诱变，经 Sanger 测序验证后，与 Bsu36I 酶切的 BmNPV-abb 基因组 DNA 共转染到 BmN-4 细胞，通过噬斑分析筛选重组体。构建重组 AcMNPVs 则使用 Bac-to-Bac 系统，将 luc 或绿色荧光蛋白（gfp）序列克隆到转移载体 pFastBac1 中，后续按试剂盒说明书操作。荧光素酶检测 ：使用荧光素酶检测系统，在 BmN-4 和 Sf-9 细胞感染重组病毒 3 天后，测定荧光素酶活性。POLH 和 GFP 积累及 OB 产生检测 ：感染重组病毒 3 天后收集 BmN-4 或 Sf-9 细胞，通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝（CBB）染色检测 POLH 和 GFP 表达，利用 ChemiDoc XRS Plus 成像系统和 Image Lab 软件进行蛋白定量。用血细胞计数器检测 BmN-4 细胞中 OB 的产生情况。逆转录 - 定量聚合酶链反应（RT-qPCR） ：感染病毒 2 天后收集细胞，用 TRI Reagent 提取总 RNA，合成第一链 cDNA 后，使用 KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒及特定引物，对 polh、luc 和 gfp 进行 RT-qPCR，通过 StepOne 实时 PCR 系统检测扩增，用 2–Ct 法计算表达值。统计分析 ：运用 Prism 9 软件进行统计分析。
实验结果
BmNPV polh 爆发序列富 A 区域突变对 polh 启动子驱动活性的影响 ：BmNPV 和 AcMNPV 的爆发序列完全相同。以表达 luc 的 BmNPV（Luc-SP）为亲本病毒，构建了四个突变体 Mut1、Mut2、Mut3 和 Mut4。Luc 报告基因检测显示，Mut1 和 Mut2 的荧光素酶活性比野生型病毒高 4 - 5 倍，Mut4 和 Mut3 的活性分别为野生型的一半和与野生型相当。这表明将 - 16 至 - 14 位的三个 A 替换为 T（TTT 突变）可增强 polh 启动子驱动的报告基因活性。富 A 区域一两个核苷酸 A - T 突变对 polh 启动子驱动活性的影响 ：构建了三个单核苷酸 A - T 突变体（T1、T2、T3）和三个双核苷酸 A - T 突变体（T12、T13、T23）。在 BmN-4 细胞中检测荧光素酶活性和 luc mRNA 水平，结果显示单核苷酸替换（T2 和 T3）使活性和 mRNA 水平略有增加，双核苷酸替换（T12、T13、T23）使活性和 mRNA 水平显著增加，但均低于 TTT 突变体。说明单核苷酸替换导致 polh 启动子驱动转录略有增加，双核苷酸替换显著增加，三核苷酸替换增加幅度最大。含 polh 编码序列（CDS）载体中 TTT 突变对 polh 启动子驱动活性的影响 ：BEVS 中基于 polh 启动子的载体分为含和不含 polh CDS 两种类型。以含 30bp BmNPV polh CDS 的 Luc-30 为对照，构建 Luc-30-TTT 突变体。在 BmN-4 细胞中的检测结果表明，Luc-30-TTT 的荧光素酶活性和 luc mRNA 水平均比 Luc-30 增加约 1.4 倍，说明 TTT 突变在含 polh CDS 的载体中也能提高报告基因表达。AcMNPV 基因组中 TTT 突变对 polh 启动子驱动活性的影响 ：以 AcMNPV 为基础的 BEVS 应用更广泛。使用含 37bp polh CDS 的 pFastBac1 为供体载体，以 luc 和 gfp 为报告基因构建重组病毒。在 Sf-9 细胞中的检测发现，TTT 突变使 GFP 表达增加约 1.5 倍（无统计学意义），Luc 活性增加约 2 倍，gfp 和 luc mRNA 水平显著增加。表明 TTT 突变在 AcMNPV - Sf-9 系统中也能增强 polh 驱动的外源基因表达。TTT 突变对产 OB 的 BmNPV 中 polh 表达的影响 ：以产 OB 的 BmNPV T3-WT 为亲本病毒构建 T3-WT-TTT 突变体。RT-qPCR 结果显示，TTT 突变使 polh mRNA 水平增加约 1.4 倍，SDS-PAGE 检测发现 POLH 表达增加约 1.2 倍，T3-WT-TTT 产生的 OB 数量比 T3-WT 多，但差异无统计学意义。说明 TTT 突变可使野生型 polh 基因的病毒中 polh 表达增加。
讨论
此前研究已确定了影响 BEVS 中外源基因表达的关键因素，如爆发序列与起始密码子间的间隔长度和 5′ polh CDS。本研究发现，polh 爆发序列富 A 区域 - 16 至 - 14 位的 AAA 突变为 TTT，能显著提高 polh 驱动的报告基因表达，且在不同类型载体、BmNPV 和 AcMNPV 以及产 OB 的病毒中均有此效果。
目前尚未明确 TTT 突变增加 polh mRNA 水平的原因，推测可能是其增加了病毒晚期因子 1（VLF-1）与爆发序列的结合亲和力，进而提高 polh 转录水平，后续需通过凝胶迁移实验或改良的染色质免疫沉淀实验等方法验证。
现有的 BEVS 大多使用 BmNPV 或 AcMNPV，其载体含爆发序列。此前虽有研究向载体引入多个爆发序列拷贝，但未发现简单核苷酸替换可增加 polh 驱动的报告基因表达。本研究发现的 TTT 突变易于引入现有 BEVS，虽未在昆虫幼虫中验证其对重组蛋白生产的影响，但有望进一步提高 BEVS 在工业生产疫苗和兽药等方面的效率。
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