《Applied and Environmental Microbiology》：The fermented cabbage metabolome and its protection against cytokine-induced intestinal barrier disruption of Caco-2 monolayers
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本文研究了实验室规模和商业发酵卷心菜中可溶性代谢物对干扰素 γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）破坏极化 Caco-2 单层细胞的保护能力。发现发酵卷心菜可保护肠道屏障，其代谢组含多种有益化合物，为探究发酵蔬菜对肠道健康的影响提供了重要依据。
引言
发酵蔬菜作为人类饮食的重要组成部分已有数千年历史。发酵过程不仅赋予食物独特风味，还能通过微生物产生的有机酸、细菌素、酒精等改善蔬菜的保存和安全性，同时转化食材中的营养成分。近年来研究表明，发酵蔬菜对人体健康有益，但具体机制尚不明确。
发酵卷心菜在全球广泛食用，其发酵过程中乳酸菌（LAB）发挥着关键作用。LAB 能分解糖类等化合物，产生乳酸、乙酸等代谢产物，这些产物不仅具有抗菌作用，还与改善肠道屏障功能、免疫功能和代谢健康有关。此外，发酵卷心菜还含有较高浓度的酚类化合物、类胡萝卜素、硫代葡萄糖苷分解产物等生物活性代谢物，其中苯乳酸（PLA）和吲哚 - 3 - 乳酸（ILA）因具有肠道屏障保护特性备受关注。
肠道上皮作为选择性渗透屏障，对维持机体健康至关重要。多种物质可影响肠道屏障完整性，如促炎细胞因子肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）能增加细胞间通透性。Caco-2 细胞模型在研究肠道屏障功能及相关疾病中发挥着重要作用。本研究旨在评估发酵卷心菜对肠道功能的潜在影响，通过检测其对极化 Caco-2 细胞模型中促炎细胞因子诱导损伤的保护能力，并对代谢物进行分析，探究发酵卷心菜影响肠道健康的机制。
材料和方法
细菌菌株生长条件和卷心菜发酵接种物的制备 ：乳酸杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NCIMB8826R（LP8826R）在特定条件下培养，离心、洗涤后制成接种物用于卷心菜发酵。实验室规模发酵 ：购买卷心菜切碎，与 2% 罐装盐混合，装入无菌袋并覆盖盐水，部分添加 LP8826R，在 22°C 下发酵不同时间，期间监测盐水 pH 和盐度。商业酸菜 ：购买同一品牌的商业酸菜，储存于 4°C，在购买后 3 天内取样，记录相关参数。肠道上皮细胞培养维持 ：Caco-2 细胞在含多种成分的完全 DMEM 培养基中培养，在特定条件下传代，用于后续实验。（发酵）卷心菜匀浆的制备 ：将约 10g 卷心菜和 1mL 盐水匀浆，稀释后用于细菌计数。用于 Caco-2 细胞实验的匀浆需离心、调 pH、过滤，确定 10%（vol/vol）的匀浆浓度用于后续实验，并制备 NaCl 溶液模拟商业发酵卷心菜的盐度。乳酸、ILA 和 D-PLA 的制备 ：购买相关化合物，配制成特定浓度溶液，超声溶解、调 pH、过滤后储存备用。肠道上皮单层细胞细胞因子刺激 ：Caco-2 细胞在 Transwell 小室中培养形成极化单层，测量跨上皮电阻（TER）筛选合适细胞。实验时先加（发酵）卷心菜匀浆或化合物，再依次加入 IFN-γ 和 TNF-α，在不同时间点测量 TER。细胞旁通透性测定 ：用荧光素异硫氰酸酯 - 葡聚糖（FITC - dextran）通量测定分化的 Caco-2 单层细胞的细胞旁通透性，计算表观渗透系数（Papp ）。ELISA 定量检测 IL-8 ：收集刺激 48h 后的基底外侧培养基，用 ELISA 法检测白细胞介素 8（IL-8）浓度。RNA 提取和逆转录定量 PCR（RT-qPCR） ：提取 Caco-2 单层细胞的 RNA，逆转录为 cDNA，用 RT-qPCR 法检测相关基因表达，以 GAPDH 为内参基因进行数据归一化。（发酵）卷心菜匀浆的代谢组学分析 ：对实验室规模发酵和商业发酵的卷心菜匀浆进行气相色谱 - 飞行时间质谱（GC-TOF/MS）和反相液相色谱 - 高分辨率串联质谱（RP-LC-HRMS/MS）分析，检测和鉴定代谢物。统计分析 ：用 GraphPad Prism 10 软件对数据进行分析，不同实验数据采用相应统计方法处理，代谢组学数据经预处理后进行主成分分析（PCA）等分析。
结果
LP8826R 主导并改变卷心菜发酵过程 ：实验室规模发酵前，卷心菜匀浆中细菌数为 3.61±0.25 log10 CFU/mL，发酵 2 天后增至 9.13±0.26 log10 CFU/mL，随后下降并维持在一定水平。添加 LP8826R 可增加总可培养 LAB 数量，使其在发酵中占主导地位，且降低盐水 pH。商业酸菜的细菌数、pH 和盐度与实验室规模发酵产物存在差异。卷心菜发酵产物可防止细胞因子诱导的肠道屏障破坏 ：确定 10%（vol/vol）的发酵卷心菜匀浆用于后续实验。IFN-γ 和 TNF-α 处理导致 Caco-2 单层细胞 TER 显著降低，而发酵卷心菜匀浆可维持 TER 在正常水平，降低细胞旁通透性，保护肠道屏障，生卷心菜和盐水则无此作用。发酵卷心菜对 IL-8 分泌和屏障调节基因表达有不同影响 ：IFN-γ 和 TNF-α 刺激使 Caco-2 单层细胞基底外侧培养基中 IL-8 浓度显著升高，商业发酵产物可降低 IL-8 水平，但仍高于未刺激对照组。发酵卷心菜匀浆对 TNF 受体（TNFR2）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和紧密连接蛋白 Claudin-2（CLDN2）基因表达影响不显著，仅 LSF + LP8826R 发酵产物的 MLCK 表达水平与未处理对照组相似。实验室规模发酵、商业发酵卷心菜和生卷心菜具有不同的代谢组 ：GC-TOF/MS 和 RP-LC-HRMS/MS 分析表明，生卷心菜和发酵卷心菜的代谢组存在显著差异，商业发酵产物与实验室规模发酵产物也有所不同，添加 LP8826R 的实验室规模发酵产物代谢组更接近商业发酵产物。发酵过程中多种代谢物发生变化，包括发酵代谢终产物、氨基酸及其衍生物等。D-PLA、ILA 和乳酸可保护 Caco-2 细胞单层免受细胞因子诱导的损伤 ：单独或组合应用乳酸、D-PLA 和 ILA 可减轻细胞因子诱导的细胞旁通透性增加，但对 TER 降低的保护作用有限，且会使 IL-8 水平升高，表明多种有益代谢物可能协同保护肠道屏障。
讨论
本研究表明发酵卷心菜的可溶性代谢物可保护 Caco-2 单层细胞免受细胞因子诱导的屏障破坏，其保护作用可能源于发酵过程中微生物产生或修饰的多种代谢物的协同效应。发酵卷心菜能维持肠道屏障功能，但对炎症反应的影响与细胞因子诱导的炎症反应不同，可能涉及多种信号通路的调节。
代谢组学分析揭示了发酵卷心菜与未发酵卷心菜代谢物的差异，以及不同发酵条件对代谢组的影响。添加 LP8826R 可改变发酵过程和代谢组，使其更接近商业发酵产物，显示出益生菌在蔬菜发酵中的应用潜力。
单独或组合应用乳酸、ILA 和 PLA 虽能部分保护肠道屏障，但整体食物中的代谢物混合物可能具有更强的保护作用。未来研究应进一步探索发酵卷心菜中其他未测试的代谢物，如酚类化合物和 GABA 的作用，同时需用更多体外模型研究发酵卷心菜及其代谢物的影响，确定其核心代谢组和推荐摄入量，以充分验证其对肠道健康的促进作用。
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