《Applied and Environmental Microbiology》：Capsid and genome damage are the leading inactivation mechanisms of aerosolized porcine respiratory coronavirus at different relative humidities
编辑推荐：
本文研究了相对湿度（RH）对气溶胶化猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的影响。发现不同 RH 通过破坏病毒衣壳和基因组使其失活，且长程 RT-qPCR 结合 RNase 处理能更好反映病毒感染性损失。该研究为控制室内冠状病毒传播提供重要依据。
研究背景
空气传播病毒如 SARS-CoV-2 和流感病毒，可通过气溶胶、飞沫和污染物传播，对社会产生严重影响。相对湿度（RH）是影响气溶胶化病毒稳定性的重要因素，但 RH 与病毒感染性之间的关系复杂且尚不明确。不同研究中，病毒在不同 RH 条件下的灭活趋势各异，有的呈单调变化，有的呈 V 形变化，还有的无明显关联。此外，不同病毒株在相同条件下也表现出不同的灭活趋势。因此，了解病毒气溶胶灭活机制对控制室内环境、降低病毒传播风险具有重要意义。本研究以猪呼吸道冠状病毒（PRCV）为模型，探究不同 RH 对气溶胶化 PRCV 的影响及病毒感染性降低的分子机制。
实验方法
病毒制备和细胞培养 ：使用猪睾丸（ST）细胞系培养 PRCV，通过斑块测定法确定其感染性。在细胞培养过程中，先将 ST 细胞接种于六孔板过夜培养，细胞达到 80% 融合度后接种 PRCV，孵育 1.5 小时后覆盖琼脂溶液，冷藏凝固后置于 37°C、5% CO2 环境下培养 4 天，最后用 10% 甲醛溶液去除凝胶，用 0.05% 结晶紫染色后计数斑块。气溶胶化实验 ：在 44L 的透明塑料实验舱内进行病毒气溶胶化实验，实验舱置于二级生物安全柜中。通过调节平衡空气入口的干燥和湿润空气流量来控制实验舱内的 RH，利用雾化器产生 PRCV 气溶胶。实验分为四个步骤：调节实验舱 RH 至低于目标值 15 - 20%；开启雾化器 5 分钟产生气溶胶；病毒暴露一定时间；暴露结束后，以 12.5LPM 的流量收集气溶胶 15 分钟。实验过程中，通过 RH 探针监测实时 RH，所有实验均在室温（22.5 ± 0.6°C）下进行，每次实验后对实验舱进行严格消毒。病毒气溶胶的分级收集 ：利用五级撞击式采样器将收集的气溶胶按粒径大小分为 > 2.5、1.0 - 2.5、0.5 - 1.0、0.25 - 0.5 和 < 0.25μm 五个范围，收集到石英滤膜上。采样结束后，将滤膜转移至含有 5mL PBS 的小瓶中，超声处理 1 小时后进行 RNA 提取和一步法 RT-qPCR 检测。粒子计数和沉积实验 ：通过光学粒子计数器（OPS）和扫描电迁移率粒子计数器（SMPS）联用，测量气溶胶化 PBS 溶液的粒子数浓度（PNC），进而计算粒子沉积系数。实验时，雾化器填充 PBS 模拟病毒气溶胶化过程，测量雾化过程中和雾化结束后 120 分钟内的 PNC，根据质量平衡方程和一阶指数衰减回归拟合计算沉积系数。检测病毒与受体相互作用 ：制备猪胃粘蛋白磁珠（PGM-MBs），将收集的气溶胶化 PRCV 与 PGM-MBs 或 PBS 混合，振荡孵育 30 分钟。之后对含有 PGM-MBs 的样本进行洗涤，再进行 RNA 提取和一步法 RT-qPCR 检测，比较处理组和对照组的 N 基因扩增水平，以确定 RH 对病毒与受体结合的影响。检测病毒衣壳稳定性 ：将收集的气溶胶化 PRCV 分别与 RNase A/T1 混合液或 PBS 孵育，然后进行 RNA 提取和长程 RT-qPCR 检测。若经 RNase 处理后 qPCR 扩增子浓度降低，则表明病毒衣壳完整性受损。检测基因组损伤 ：采用一步法 RT-qPCR 和长程 RT-qPCR 检测 PRCV 的 N 基因。一步法 RT-qPCR 用于扩增 93bp 的短片段，长程 RT-qPCR 则扩增 1562bp 的片段。长程 RT-qPCR 包括三个步骤：将 N RNA 逆转录为 cDNA；对 cDNA 进行长程 PCR 扩增；对扩增产物进行 qPCR 定量。通过比较不同处理组和对照组的 N 基因扩增水平，判断基因组是否受损。统计分析 ：采用 Shapiro-Wilk 检验检查数据正态性，对于正态分布数据使用配对 t 检验，非正态分布数据使用 Wilcoxon 符号秩检验。比较不同处理组之间的差异，包括珠子处理组与未处理组、RNase 处理组与未处理组、不同时间点长程 RT-qPCR 数据与 0 分钟数据、一步法 RT-qPCR 数据与斑块测定数据等，以分析 RH 对病毒各方面的影响。
实验结果
粒子沉积对病毒去除的影响可量化 ：实验系统产生的 PRCV 气溶胶粒径主要在 0.25 - 2.5μm 之间，其中 0.25 - 0.5μm 粒径范围的病毒基因组占比最高。通过实验测定了粒子沉积系数与粒径的关系，得到沉积系数（k ；min-1 ）与粒子直径（Dp ；nm）的函数关系。根据该关系计算出不同粒径气溶胶在不同暴露时间下的悬浮百分比，并进一步计算出所有粒径范围气溶胶的总体剩余百分比。通过校正因子排除沉积对病毒浓度测量的影响，发现经校正后 PRCV 基因组的去除率更能反映病毒的真实稳定性。同时，实验中使用 20mL SKC 生物采样器收集气溶胶化 PRCV 的效率约为 2%，为减少收集效率对实验结果的影响，保持实验条件一致并对数据进行归一化处理。RH 影响病毒衣壳和基因组的完整性 ：通过 PGM-MBs 结合实验发现，在测试的 RH 范围内，RH 未改变 PRCV 与 PGM-MBs 的结合能力，表明 RH 对病毒刺突蛋白影响不明显。RNase 处理实验结果显示，在 RH 55 - 65% 时，多个时间点经 RNase 处理的样本 N 基因扩增子水平显著降低，说明该 RH 条件对病毒衣壳完整性影响最大，其他 RH 水平也有部分时间点出现类似情况，但可能存在实验变异性。长程 RT-qPCR 检测基因组完整性发现，RH 45 - 55% 和 65 - 75% 时，多个时间点 PRCV 气溶胶的 N 基因扩增子水平显著降低，表明这两个 RH 范围会导致病毒基因组受损，而 RH 55 - 65% 和 75 - 85% 时，N 基因扩增子水平无显著变化。长程 RT-qPCR 结合 RNase 处理能反映 PRCV 感染性损失 ：通过斑块测定和不同分子检测方法比较发现，斑块形成单位（PFU）在 30 分钟内下降了 3 log10 ，而一步法 RT-qPCR 检测的 N 基因扩增子浓度仅下降 1 log10 ，说明 PFU 下降速度比 N 基因扩增子快至少一个数量级。在 RH 65 - 75% 条件下，长程 RT-qPCR 结合 RNase 处理与斑块测定结果的比较表明，前者能更好地反映气溶胶化病毒的感染性损失。进一步研究发现，在所有 RH 水平下，10 分钟和 30 分钟时，RH 75 - 85% 的病毒稳定性最高，随着暴露时间增加，RH 55 - 65% 和 65 - 75% 的病毒基因组去除率增加，而 RH 45 - 55% 在 10 分钟时就达到 3-log 的基因组去除率且不再随时间增加。
讨论
本研究发现 PRCV 在较高 RH（75 - 85%）下具有最高的生存能力，但未发现 RH 与病毒灭活之间的单调关系。不同病毒在不同 RH 条件下的存活情况差异与病毒类型、喷雾介质、环境条件和病毒气溶胶化 / 收集过程等多种因素有关。通过对 PRCV 基因组和衣壳稳定性的研究，发现 RH 45 - 55% 和 65 - 75% 主要导致基因组损伤，RH 55 - 65% 主要影响衣壳完整性，RH 75 - 85% 时病毒相对稳定。然而，RNase 检测方法存在局限性，当病毒衣壳和基因组同时受损时，难以区分两者的损伤情况。
关于气溶胶化病毒灭活的化学机制，可能涉及相分离、结晶和 pH 变化等。本研究推测，在高 RH（75 - 85%）下，气溶胶化病毒粒子保持较高的水合状态；而在较低 RH 下，加速脱水可能导致病毒粒子表面理化性质改变，如溶质积累，从而破坏病毒完整性，使基因组暴露于环境中降解。但这一假设还需要进一步研究证实。
传统的细胞检测方法如斑块测定虽然能检测感染性病毒粒子，但存在成本高、耗时耗力且不适用于多种病毒的问题。因此，研究人员常使用 PCR 技术检测病毒基因组作为感染性病毒粒子的替代指标。本研究发现，RT-qPCR 检测可能高估气溶胶化病毒粒子的传播风险，而 RNase 处理后进行长程 RT-qPCR 可能是更准确的检测感染性病毒粒子的方法。
本研究存在一定局限性。例如，撞击式采样器对最小和最大粒径粒子的尺寸信息提供不详细；使用气溶胶化 PBS 粒子测定沉积系数可能与病毒粒子存在差异；实验使用 PBS 作为病毒稀释和收集介质，与人体呼吸液不同；粒子尺寸分布检测包含了活病毒和死病毒，而斑块测定仅针对感染性病毒，两者数据不能直接关联；PGM-MBs 检测存在一定局限性；长程 qPCR 仅扩增了部分 N 基因区域；实验模拟的 RH 范围有限。尽管如此，本研究仍为了解 PRCV 病毒气溶胶在不同 RH 下的灭活机制提供了有价值的信息，其发现的 RH 与病毒灭活之间的关系和机制框架可用于评估冠状病毒在室内环境中的行为，为室内湿度控制以降低病毒传播风险提供了科学依据。后续研究可进一步评估盐积累和 pH 波动对病毒的影响，研究 RH 对悬浮在合成唾液或其他合成体液中病毒的作用，以及探究低 RH 水平下的病毒灭活机制。
打赏
下载安捷伦电子书《通过细胞代谢揭示新的药物靶点》探索如何通过代谢分析促进您的药物发现研究
10x Genomics新品Visium HD 开启单细胞分辨率的全转录组空间分析！
欢迎下载Twist《不断变化的CRISPR筛选格局》电子书
单细胞测序入门大讲堂 - 深入了解从第一个单细胞实验设计到数据质控与可视化解析
下载《细胞内蛋白质互作分析方法电子书》
