《Cell Death Discovery》：E3 ligase Skp2-mediated stabilization of survivin contributes to radioresistance
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为解决口腔鳞状细胞癌（OSCC）放疗抵抗的难题，研究人员开展了关于 E3 连接酶 Skp2 在 OSCC 放疗抵抗中作用机制的研究。结果发现 Skp2 可稳定 Survivin，靶向 Skp2-Survivin 轴能提高放疗敏感性，为 OSCC 治疗提供新策略。
在口腔健康领域，口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）是一种常见的头颈部恶性肿瘤。目前，针对 OSCC 的治疗主要是根治性手术辅以放疗，但放疗效果却不尽人意，放疗抵抗成为了临床上亟待解决的重大难题。这就好比在一场战斗中，癌细胞就像狡猾的敌人，放疗本是有力的武器，却因为敌人的 “抵抗盾牌” 而威力大减。为了打破这一困境，来自中南大学湘雅三医院等机构的研究人员开展了深入研究。该研究成果发表在《Cell Death Discovery》上，为攻克 OSCC 放疗抵抗带来了新的希望。
研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，通过构建 shRNA/sgRNA 细胞系来调控基因表达；利用 MTS 法、集落形成实验检测细胞活力和增殖能力；借助 Caspase 3 活性检测、Western blotting（WB）、Co - 免疫沉淀（Co-IP）、泛素化分析等技术探究细胞凋亡和蛋白相互作用机制。在动物实验方面，建立了体内肿瘤模型，使用免疫组化（IHC）染色分析肿瘤组织相关蛋白表达。此外，还收集了临床组织样本进行研究。
下面来看具体的研究结果：
- Skp2 与 OSCC 恶性表型的相关性：免疫组化实验表明，Skp2 在 OSCC 组织中表达显著上调。构建 Skp2 敲低稳定细胞系后发现，其可抑制 OSCC 细胞活力和集落形成能力，在体内实验中，Skp2 敲低的异种移植瘤体积和重量明显减小，这说明 Skp2 对维持 OSCC 细胞的恶性表型至关重要。
- Skp2 缺失促进 OSCC 细胞在 IR 作用下的凋亡：MTS 实验和软琼脂实验显示，Skp2 敲低降低了 CAL27 和 SCC25 细胞活力，增强了 IR 的抗肿瘤作用。通过使用泛凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 预处理细胞、检测细胞内细胞色素 C 释放、Bax 蛋白表达以及 cleaved-caspase 3 的表达和活性，证实了 IR 抑制 Skp2 敲低的 OSCC 细胞活力并促进其凋亡。
- Survivin 下调促进 Skp2 缺陷型 OSCC 细胞凋亡：研究发现 IR 处理会下调 Skp2 敲除的 CAL27 和 SCC25 细胞中 Survivin 蛋白表达，构建 Survivin 基因沉默细胞系后，细胞在 IR 处理下活力减弱，caspase 3 活性升高。转染 Flag-Skp2 到 Skp2 敲除的口腔鳞状癌细胞中，可恢复 Survivin 蛋白水平、细胞活力和集落形成能力，表明 Skp2 对维持口腔鳞状癌细胞中 Survivin 表达是必需的。
- Skp2 缺陷促进 Survivin 泛素化和降解：用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理 Skp2 缺陷的细胞，发现可稳定 Survivin。内源性泛素化实验和 WB 结果显示，IR 处理促进了 Skp2 缺失的 CAL27 细胞中 Survivin 的 K48 连接的多聚泛素化。Skp2 缺失使 Survivin Thr34磷酸化水平降低，构建 Survivin T34D 突变体发现其可抵抗 IR 对 Survivin 表达的影响，延长 Survivin 半衰期，减少泛素化，恢复细胞活力、集落形成能力并降低 caspase 3 活性。
- Skp2 促进 FBXL7 介导的 Survivin 泛素化和降解：研究发现 Skp2 缺失会降低 Akt 磷酸化水平，影响 Akt 泛素化修饰。Skp2 通过 Akt/Wee1 信号轴维持 Survivin 稳定，抑制 Akt 信号会导致 Skp2 缺失的 OSCC 细胞中 Survivin 降解。沉默 FBXL7 可恢复 Survivin 表达，且 Survivin Thr34磷酸化会减弱其与 FBXL7 的相互作用，Skp2 敲除且 IR 处理会增强 FBXL7 与 Survivin 的相互作用。
- Skp2 缺失促进 OSCC 细胞体内放疗敏感性：利用 Skp2 敲除的 CAL27 稳定细胞建立异种移植瘤模型，结果显示 Skp2 敲除的肿瘤生长缓慢，IR 处理后体积更小，小鼠生存时间延长。IHC 染色表明，Skp2 敲除或放疗会降低 Ki67 和 Survivin 表达，联合放疗效果更显著。使用 Akt 抑制剂 MK2206 的实验也得到类似结果。
- Skp2 与 Survivin 在 OSCC 组织中的相关性：对 74 例患者肿瘤组织进行 IHC 分析，发现 Skp2、p-Akt 和 Survivin 在 OSCC 组织中均高表达且呈正相关。利用 GEO 数据集分析也得到了相同结论。
- Skp2 在放疗抵抗的 OSCC 细胞中高表达：检测两对放疗抵抗细胞系发现，Skp2 在 CAL27-IR 和 SCC25-IR 细胞中高表达。MTS 实验和软琼脂集落形成实验表明，放疗抵抗细胞系具有更强的活力和集落形成能力。Skp2 敲除会降低放疗抵抗细胞中 Survivin 蛋白表达、细胞活力和集落形成能力，联合放疗效果更明显，且 Skp2 敲除会增强 DNA 损伤信号。
- 抑制 Skp2 克服 OSCC 细胞放疗抵抗：使用 Skp2 特异性抑制剂 SZL P1-41 处理放疗抵抗细胞系，发现其可降低细胞活力和集落形成能力，增加 caspase 3 活性和 cleaved-caspase 3 蛋白水平，联合放疗效果更显著。在异种移植瘤模型中，SZL P1-41 联合放疗可抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间，降低 Ki67 和 Survivin 表达。
在研究结论和讨论部分，研究表明 Skp2 在 OSCC 细胞放疗抵抗机制中起着关键的调控作用，它通过激活 Akt/Wee1 信号轴稳定 Survivin。这意味着靶向 Skp2-Akt-Survivin 轴并结合传统放疗，有望显著提高口腔鳞状细胞癌的治疗效果。该研究不仅为理解 OSCC 放疗抵抗机制提供了新的视角，也为开发更有效的治疗策略奠定了坚实基础，为众多 OSCC 患者带来了新的希望。
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