尽管多年研究对 ZGA 有了一定了解，但调控 ZGA 的分子机制及其对发育能力的贡献仍有待深入探索。在 ZGA 过程中，转录因子（transcription factors，TFs）和共激活因子发挥着关键作用。转录因子能与特定 DNA 序列结合，激活基因转录，进而触发 ZGA，如小鼠中的 OBX 家族，可招募 RNA 聚合酶 II（RNA polymerase II，Pol II）到 ZGA 基因的启动子区域。然而，转录因子单独作用不足以激活特定基因表达，还需共激活因子的参与。

组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）p300 和 CBP（统称 p300/CBP）是重要的转录共激活因子，在真核生物转录调控网络中处于核心地位，参与众多信号通路和生理过程，尤其在脊椎动物发育中作用关键。在小鼠胚胎发育研究中，发现 p300/CBP 对基因组重编程和 ZGA 至关重要，但具体机制尚不明确。本研究旨在深入探究 p300/CBP 与 TFs、Pol II 协同调控 ZGA 的作用和机制。

研究人员首先分析了小鼠卵母细胞和植入前胚胎中 p300/CBP 的表达水平，通过分析已发表数据和免疫染色实验，发现 Ep300 和 Crebbp 在母源中表达，且在二细胞阶段显著激活，p300/CBP 蛋白在整个植入前发育阶段都维持较高水平，这表明其可能在母源 - 合子转变过程中发挥作用。

为进一步探究 p300/CBP 在植入前发育中的功能，研究人员使用高度选择性抑制剂 A485 抑制其催化活性。结果显示，在不同发育阶段抑制 p300/CBP 会产生不同影响。在 major ZGA 阶段短暂抑制，胚胎会在致密化前停滞；在 minor ZGA 或整个 ZGA 阶段抑制，则导致胚胎发育停滞在二细胞阶段。从 L2C 或四细胞阶段到囊胚阶段抑制 p300/CBP，会影响囊胚发育，但在八细胞到囊胚阶段抑制则无明显影响。这表明 p300/CBP 的乙酰转移酶活性对 ZGA 和植入前胚胎发育至关重要，尤其是在 minor ZGA 阶段，对胚胎发育超越二细胞阶段不可或缺。

研究人员对 E2C 和 L2C 胚胎进行 RNA 测序（RNA-seq），结果表明，抑制 p300/CBP 会导致 ZGA 相关基因表达异常。在 E2C 阶段，73.8% 的 minor ZGA 基因下调，包括 Dux、Obox4 和 Zscan4s 等转录因子；在 L2C 阶段，65.5% 的 major ZGA 基因显著减少，如 Obox3/6、Dppa2/4 和 Nr5a2 等。此外，还观察到一些基因的异位转录、组蛋白去甲基化酶 Kdm5b 表达下降以及 H3K4me3 去甲基化受损等现象，这些都表明抑制 p300/CBP 会导致 ZGA 失败，从 minor ZGA 到 major ZGA 的转变受阻。

由于 p300 和 CBP 高度同源，后续研究主要聚焦于 p300。研究人员采用 Stacc-seq 技术，研究 p300 在对照（野生型，WT）和 A485 处理的 L1C、E2C 和 L2C 胚胎中的分布情况。结果显示，p300 结合位点大多位于基因转录起始位点（transcription start site，TSS）远端，但启动子区域的 p300 占有率较高，且在不同胚胎发育阶段呈现出明显的特异性分布。

在 L1C 阶段，p300 优先富集在与母源和发育相关基因的高 CG 启动子区域；到 E2C 阶段，p300 从发育基因区域解离，开始在 ZGA 基因的低 CG 启动子区域富集；L2C 阶段，p300 在 ZGA 基因上的富集进一步增加。同时，H3K27ac 和染色质可及性也呈现出与 p300 类似的动态变化。这些结果表明，p300 在 E2C 阶段就开始在 ZGA 基因上预加载，类似于之前观察到的 Pol II 的预配置，说明 p300 有助于 Pol II 在 ZGA 基因上的预配置，且 p300 和 H3K27ac 在 major ZGA 之前就已被预配置到中间状态。

在 2C 胚胎中，研究人员发现约 90% 的 p300 峰与 Pol II 共定位，且启动子结合的 Pol II 峰中，与 p300 共享的峰具有更高的 Pol II 占有率，相关基因的转录水平也更高。这表明 p300 与 2C 阶段 ZGA 基因上 Pol II 的高富集有关，有助于小鼠 ZGA 基因的主动转录。

当抑制 p300/CBP 的催化活性时，L2C 特异性区域的 p300 积累受到影响，导致 Pol II 积累减少，相关基因表达下调。同时，p300 和 Pol II 在 L1C 特异性靶点异常滞留，相关基因异位激活。此外，研究还发现，p300/CBP 催化的乙酰化促进了 p300 和 Pol II 从发育基因的 CG 高启动子向 ZGA 基因的 CG 低启动子的定位转变，这一过程依赖于 p300/CBP 的乙酰转移酶功能。

进一步研究发现，抑制 p300/CBP 会影响 Pol II 的延伸。通过比较 Pol II 暂停指数（pausing index，PI），发现 A485 处理后，E2C 和 L2C 阶段的 Pol II PI 显著增加，表明 Pol II 延伸受损。尽管一些基因的 p300 富集无明显变化，但 H3K27ac 富集减少，这说明 H3K27ac 不足会对这些基因的 Pol II 延伸产生负面影响，进一步证明了 p300/CBP 乙酰转移酶活性在促进 ZGA 基因中 Pol II 延伸的作用。

超级增强子（super - enhancers，SEs）是由多个增强子聚集形成的区域，其特征是结合大量的主转录因子和介质，驱动关键细胞身份基因的高水平表达。研究人员通过 ROSE 算法，根据远端 p300 和 H3K27ac 信号对增强子进行排名，从而识别出 ZGA 阶段的 SEs。结果共鉴定出 788 个 L1C 特异性、612 个 E2C 特异性和 1156 个 L2C 特异性 SEs，并将其余增强子归类为典型增强子（typical enhancers，TEs）。

研究发现，SEs 比 TEs 具有更广泛和更强的 p300 和 H3K27ac 信号，SE 相关基因（SE - genes）在 E2C 和 L2C 阶段的表达水平通常高于 TE 相关基因（TE - genes）。从 L1C 到 L2C，p300 增强子景观发生动态变化，L1C 特异性 p300 增强子在 E2C 胚胎中几乎消失，而 L2C 特异性 p300 增强子在 E2C 阶段建立并持续富集到 L2C。DNA 基序富集分析表明，OBX 基序是 E2C 和 L2C 胚胎中 p300 远端峰内最常见的 TF 结合基序。

此外，SE - genes 参与了 ZGA 和植入前胚胎发育的关键过程，包括转录因子（如 Dux、Nr5a2 和 Yy1）、表观遗传修饰（如 Brd4、Kdm5b、Rbbp7 和 Ep300）以及各种生物学过程（如 Nop2）。这揭示了一个由 SEs 组成的复杂调控网络，对 ZGA 和植入前胚胎发育相关基因起调控作用。

研究人员对比了 DMSO 和 A485 处理组中远端 p300 水平的变化，发现 A485 处理后，L1C 和 E2C 胚胎中远端 p300 峰的频率显著降低，这表明在缺乏乙酰转移酶活性时，p300 有向启动子区域积累的趋势。在增强子区域，A485 处理导致 E2C 和 L2C 阶段 p300 水平显著下降，同时 H3K27ac 和染色质可及性也降低，增强子 RNA（enhancer RNAs，eRNAs）表达大幅减少，这表明 p300/CBP 抑制导致增强子失活，进而使附近基因，尤其是 SE - genes 表达显著下调。

重要的是，A485 处理导致 E2C 胚胎中 Dux 表达下调，进而使 DUX 基序在 p300 富集显著降低的区域富集，DUX 靶基因表达减少。这表明 DUX 作为 E2C 阶段的主转录因子，对增强子形成和调控关键基因表达至关重要，而 p300/CBP 的活性对 minor ZGA 中的增强子功能至关重要，进而调控启动 major ZGA 的关键基因。

鉴于 A485 处理导致 DUX 缺乏，进而影响 minor ZGA，研究人员探究外源性 Dux 过表达（Dux - OE）是否能挽救胚胎发育。研究人员将 Dux - Flag mRNA 注入受精卵，然后用 DMSO 或 A485 处理。结果显示，在 A485 处理组中，注入少量外源性 Dux mRNA 后，近一半胚胎能发育超越二细胞阶段，部分胚胎可发育至囊胚或桑葚胚阶段，且 Dux 呈现剂量依赖性效应，过量会导致二细胞停滞。这表明 Dux 在促进 p300/CBP 抑制后的胚胎发育中起重要作用。

转录组分析表明，在 L2C 阶段，Dux - OE 能广泛挽救 A485 处理组中差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的表达，包括许多 major ZGA 基因。在 E2C 阶段，Dux - OE 也能部分改善基因表达异常，且上调的基因主要富集在 minor ZGA 基因中。尽管 E2C 阶段只有部分基因表达恢复，但到 L2C 阶段，这些基因的表达水平恢复到 DMSO 组的基线水平。这表明 Dux - OE 能触发 minor ZGA 的启动，使 minor 和 major ZGA 在 L2C 阶段顺序激活完成。研究还发现，Dux - OE 的时机很关键，在 E2C 阶段进行 Dux - OE（与 A485 洗脱时间一致），部分胚胎能发育至囊胚阶段，但有发育延迟；而在 M2C 阶段进行 Dux - OE，胚胎则停滞在二细胞阶段。

为探究 Dux - OE 挽救 ZGA 的机制，研究人员检测了 p300 和 Pol II 富集的变化。在 L2C 阶段，A485 + Dux 组中 Pol II 的富集在整体上得到恢复，在 L1C 特异性区域减少，在 L2C 特异性区域增加，达到与 DMSO 组相当的水平。虽然 p300 和 H3K27ac 水平也有一定恢复，但与 Pol II 的恢复并不完全对应，表明 Pol II 富集的恢复并不完全依赖于 p300。此外，Dux - OE 后，远端增强子区域的 p300 和 H3K27ac 富集显著增加，eRNA 表达也升高，这表明恢复的 p300 增强子活性有助于 L2C 阶段 ZGA 基因中 Pol II 的招募和延伸。

在 E2C 阶段，Dux - OE 导致 Pol II 在 minor ZGA 基因中的富集部分恢复，与 minor ZGA 基因表达增加相关。此时 p300 和 H3K27ac 的富集没有显著恢复，可能是由于 p300 的催化活性受到<