《Applied and Environmental Microbiology》：Rediscovery of viomellein as an antibacterial compound and identification of its biosynthetic gene cluster in dermatophytes
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这篇研究重新发现红色菌素（Viomellein）是皮肤癣菌产生的抗菌化合物，鉴定其生物合成基因（vio）簇。研究揭示其生物合成途径，发现该基因簇在皮肤癣菌中广泛保守。这为理解皮肤癣菌感染机制及微生物间相互作用提供新视角。
### 引言
皮肤癣菌是皮肤和指甲感染的主要病原体，全球超十亿人受其影响。主要致病菌种包括红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）和须癣毛癣菌（Trichophyton tonsurans）等。感染时宿主炎症反应低，病原体产生的色素有时在感染部位可见，但皮肤癣菌在分子层面的生理和生物学研究较少。
人体皮肤微生物群复杂，受多种因素影响，不同个体和解剖部位组成不同。足部细菌密度较高，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）细菌常见。然而，共生细菌在皮肤癣菌感染过程中的生态作用及二者间的化学和物理相互作用尚不清楚。
此前有研究表明皮肤癣菌能产生抗生素，如青霉素样物质、链霉素样活性物质等，但抗生素化合物产生的化学基础未被报道。除已知抗生素化合物外，皮肤癣菌产生的次生代谢物研究较少，如 neosartoricin B、xanthomegnin 等，其遗传特征和在感染中的作用有待验证。本研究旨在重新探索皮肤癣菌产生的抗生素化合物，为理解皮肤微生物群在感染中的生态弹性提供依据。
结果
皮肤癣菌的非青霉素类抗生素活性 ：红色毛癣菌和须癣毛癣菌在培养基上呈现橙色至红色色素沉着。扩散试验显示，它们对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）有抑制作用，但对大肠杆菌（Escherichia coli）无作用，且抗生素活性不因青霉素酶存在而消失，表明其产生的不是含 β - 内酰胺环的化合物。纸碟试验中，除犬小孢子菌（Microsporum canis）外，多种皮肤癣菌的细胞提取物对革兰氏阳性菌有抑制作用，多数无抗真菌活性。红色菌素及相关化合物的鉴定 ：培养红色毛癣菌 IFM 64539，经有机溶剂提取、分离，得到两种抗菌红色色素。通过高分辨率电喷雾电离质谱（HRESIMS）确定其分子式为 C30 H24 O11 ，与真菌色素红色菌素一致。经 LCMS 分析，将其与标准品对比，确认这两种化合物为红色菌素。红色菌素生物合成基因的鉴定 ：整理多种皮肤癣菌基因组中的次生代谢核心基因，发现不同物种间有 16 个共享基因。对红色毛癣菌进行比较转录组分析，在能产生红色菌素的琼脂平板培养条件下，有四个基因表达水平较高。考虑到红色菌素的结构，TERG_02850 被认为是最可能的生物合成候选基因。AntiSMASH 预测该基因簇包含九个基因，分别为氧化还原酶、转录因子、转运蛋白等，且这些基因在琼脂培养中的表达水平高于液体培养，表明该基因簇参与红色菌素生物合成，将其命名为 vioO2、vioR、vioT、vioM、vioL、vioF、vioC、vioO1 和 vioA。通过缺失突变验证红色菌素生物合成基因 ：利用 CRISPR/Cas9 系统 构建红色毛癣菌 IFM 46035 中 vioA 基因的缺失突变体。获得两个独立突变体，经基因组 PCR 和 Southern 杂交分析验证。突变体在 PDA 上无深棕色色素沉着，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性丧失或减弱，且代谢产物中未检测到红色菌素，表明 vioA 对红色菌素生物合成至关重要。通过异源表达研究红色菌素的生物合成途径
去甲托拉内酯（nor - toralactone）和半紫黄质（semivioxanthin）的产生 ：在米曲霉（Aspergillus oryzae）中依次重建 vio 基因簇基因。构建表达 PKS vioA 的菌株 Ao_vioA，产生化合物 3，推测其为去甲托拉内酯。构建表达 vioC 和 vioM 以及 vioA 的菌株 Ao_vioACM，产生半紫黄质，经与商业标准品对比验证。紫黄质（vioxanthin）的产生 ：向 Ao_vioACM 中引入 vioO1 和 vioO2 基因，构建 Ao_vioACMO1O2 菌株，其主要代谢产物为半紫黄质，表明 VioO1 和 VioO2 不能将半紫黄质氧化为半 xanthomegnin 或其他代谢物。体外反应系统证实 VioF 和 VioL 参与半紫黄质二聚化形成紫黄质。红色菌素的产生 ：构建表达七个 vio 基因的菌株 Ao_vioACMO1O2FL，LCMS 分析显示该菌株产生红色菌素、xanthomegnin、半紫黄质和半 xanthomegnin 等代谢物，表明这七个 vio 基因是生物合成红色菌素所必需且充分的，虽最终合成步骤未确定，但提出了红色菌素及相关化合物的生物合成途径。 皮肤癣菌中红色菌素产生的保守性 ：基于 BLAST 序列相似性搜索，vio 基因簇在多种皮肤癣菌中高度保守。检测多种皮肤癣菌临床分离株的代谢产物，发现多数菌株能产生红色菌素、紫黄质和 xanthomegnin，但犬小孢子菌分离株不产生。不同皮肤癣菌产生这些化合物的水平存在差异，具有物种依赖性。测定红色菌素及相关化合物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌（Candida albicans）的最小抑菌浓度（MIC），红色菌素对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的活性最高。
讨论
真菌在自然环境和宿主生物中能产生多种次生代谢物，抗生素代谢物可能保护真菌免受周围微生物影响，对感染建立至关重要。本研究重新发现红色菌素为抗菌化合物并鉴定其生物合成基因，有助于阐明皮肤癣菌与皮肤表面微生物群落的相互作用，推动对皮肤癣菌感染过程的理解。
抗菌萘并吡喃酮二聚体化合物如红色菌素、xanthomegnin 和紫黄质在谷物、动物饲料及表皮临床材料中均有检测到。多种真菌可产生这些化合物，虽分布广泛，但此前缺乏其生物合成途径的遗传特征研究。vio 基因簇的鉴定为真菌中这些复杂结构和丰富活性的萘并吡喃酮化合物的多样性提供了遗传解释，为评估其生态和病理功能奠定基础。
此前预测了与紫黄质相关的二聚萘并吡喃酮 viriditoxin 的生物合成基因簇，其中漆酶基因编码的偶联酶可催化半 viriditoxin 二聚化形成 viriditoxin 及半紫黄质转化为紫黄质。本研究证实红色毛癣菌的 VioL 可催化半紫黄质二聚化形成紫黄质，且红色毛癣菌分离株中单体底物难以检测，表明二聚化步骤快速。VioO1 和 VioO2 的氧化反应可产生不同产物，增加化学多样性，可能是真菌与其他生物相互作用的生存策略。
抗菌活性测试显示，红色菌素对金黄色葡萄球菌的 MIC 最低，与氯霉素相当，且对多种癌细胞系有细胞毒性。xanthomegnin 是诱导型一氧化氮合酶的有效抑制剂。这些特性表明红色菌素除影响皮肤微生物群外，可能还参与皮肤癣菌的致病过程，其在皮肤癣菌发病机制中的潜在作用是未来研究的重要方向。
材料和方法
菌株 ：本研究使用的皮肤癣菌菌株由日本国家生物资源项目提供，用于生物测定的细菌和真菌菌株分别从千叶大学医学真菌研究中心和 NITE 生物资源中心获得。米曲霉 NSAR1 用于异源表达实验，大肠杆菌 DH5α 用于质粒构建。培养基 ：使用 SDA、PDA 和 SDB 培养真菌，根据不同培养需求调整温度和添加成分。化学试剂 ：红色菌素、xanthomegnin、半紫黄质和半 xanthomegnin 标准品购自商业公司。生物测定 ：采用扩散试验和纸碟试验检测抗菌活性，根据不同菌株和检测目的准备培养基和样品。抗菌化合物的纯化 ：培养红色毛癣菌，经多步提取、分离和纯化，使用 HPLC 和 HRESIMS 分析生物活性和化合物结构。RNA 测序分析 ：培养红色毛癣菌，提取 RNA 进行文库制备和测序，计算 TPM 值分析基因表达水平。构建用于米曲霉异源表达的质粒 ：选择合适的载体，制备基因片段并插入载体构建表达质粒，经鉴定后用于异源表达。米曲霉的转化 ：培养米曲霉，制备原生质体，采用原生质体 - 聚乙二醇（PEG）方法进行转化。代谢物分析 ：使用 HPLC 进行代谢物分析，采用梯度洗脱条件。体外反应 ：制备米曲霉酶提取物，与底物孵育，经处理后用 HPLC 或 LCMS 分析反应产物。vioA 缺失突变体的构建 ：提取红色毛癣菌基因组 DNA，制备基因缺失片段，合成 RNP 复合物，通过 PEG 介导的方法将其导入原生质体，筛选和验证突变体。
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