### 引言
脂肪酸合成（FAS）在真核生物和细菌中都至关重要，多数细菌利用 II 型脂肪酸合酶系统（FAS II）合成脂肪酸。该过程依赖一系列小的可溶性蛋白，涉及起始和延伸两个阶段。通常，3 - 酮酰 - ACP 合酶 III（KASIII）如大肠杆菌（Escherichia coli）的 FabH，在脂肪酸合成起始阶段发挥关键作用，但后来发现丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶（Mad）也能介导脂肪酸合成起始。

结果

1. Xoo 和 Xcc 均编码含 YiiD_C 结构域的假定蛋白：Xoo 中 PXO_03973（Xoo MadB）和 Xcc 中 XC_0210 编码的蛋白均含 YiiD_C 结构域，Xoo MadB 与已知 Mad 蛋白序列同一性低，但保留关键保守氨基酸残基，Xcc MadB 与 Xoo MadB 有 87.5% 的序列同一性，这引发了对它们功能的研究。
2. Xoo madB 和 Xcc madB 均编码有活性的丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶：将 Xoo madB 和 Xcc madB 基因片段分别导入 Ralstonia solanacearum fabH 缺失突变体（ΔRsfabH）和 Escherichia coli fabH 突变体（ΔEcfabH），结果显示这两个基因能恢复突变体生长，表明它们编码的蛋白在 FAS 起始中发挥作用，可能是功能性丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶。进一步实验表明，过表达 Xoo madB 或 Xcc madB 可挽救 Escherichia coli ?fabH?madA 的合成致死性，有力证明它们编码丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶。
3. Xoo MadB 和 Xcc MadB 在体外均具有丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶活性：在体外表达并纯化 Xoo MadB 和 Xcc MadB，实验发现它们不能催化乙酰 - CoA 与丙二酸单酰 - ACP 的缩合反应，但能以丙二酸单酰 - ACP 为底物，在其他相关蛋白存在下生成长链酰基 - ACP，证明它们具有丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶活性。而且，Xcc MadB 的比活性仅为 Xoo MadB 的 65%，说明 Xcc MadB 的活性显著低于 Xoo MadB。
4. madB 对 Xoo 和 Xcc 在宿主植物中的致病性至关重要：构建 Xoo madB 和 Xcc madB 基因缺失突变体，发现突变体均能存活，但生长速率和对环境胁迫的敏感性发生变化。Xoo ΔmadB 突变体生长略慢，仅对 H?O?更敏感；Xcc ΔmadB 突变体对多种胁迫更敏感，且膜通透性增加。叶剪接种实验表明，madB 基因缺失显著降低了 Xoo 和 Xcc 在各自宿主植物上的致病性。
5. madB 参与 Xoo 和 Xcc 毒力相关因子的产生：分析 Xoo 和 Xcc 突变体的毒力相关因子，发现 madB 基因缺失对胞外酶分泌影响不大，但显著降低了胞外多糖（EPS）的产生。在 Xoo 中，添加醋酸钠可恢复 EPS 合成，而在 Xcc 中则不能。此外，madB 突变对 Xoo 和 Xcc 生物膜形成和运动性的影响不同，且会改变 DSF 家族信号的产生，Xoo 中主要增加支链 DSF 家族信号，Xcc 中主要增加直链 BDSF 信号。
6. MadB 在 Xoo 和 Xcc 的脂肪酸合成中功能不同：分析 Xoo 和 Xcc madB 突变体膜脂的脂肪酸组成，发现 Xoo ΔmadB 突变体中直链脂肪酸显著减少，支链脂肪酸明显增加；而 Xcc ΔmadB 突变体的脂肪酸组成变化较小。这表明在 Xoo 中，MadB 介导的 FAS 途径独立于 FabH 途径；在 Xcc 中，FabH 介导的途径是主要的，MadB 途径起辅助和调节作用。
7. madB 在 Xoo 和 Xcc 中具有不同的遗传特征：构建 Xoo ΔfabH1ΔmadB 双突变体失败，引入外源 madA 或 madB 基因后，在 IPTG 诱导下可获得双突变体，但部分菌株在无 IPTG 诱导时无法生长，证明 Xoo 中 MadB 和 FabH 途径相互独立。在 Xcc 中，过表达 madB 可部分补偿 fabH 突变导致的生长缺陷，但高活性的 Xoo MadB 过表达会抑制生长，说明 FabH 途径在 Xcc 的脂肪酸合成中起主要作用。
8. madB 在 Xoo 和 Xcc 中的基因排列不同：研究 madB 基因的基因组组织发现，在多数 Xanthomonas 物种中，madB 及其相邻基因的排列相似，但 Xoo 中 madB 与相邻基因的排列独特，有 DNA 片段插入，且上游有转座酶基因，这表明 madB 在 Xoo 中经历了不同的进化途径。同时，Xoo 和 Xcc 的 madB 基因上游调控区域存在差异，暗示其表达调控不同。
9. madB 在 Xoo 和 Xcc 中的基因表达调控不同：RT - PCR 表明 madB 在 Xoo 和 Xcc 中均独立转录。转录起始位点分析显示，Xoo 和 Xcc 的 madB 转录起始位点位置不同。β - 内酰胺酶报告系统分析发现，Xoo madB 表达受多种机制严格调控，Xcc madB 则组成型表达，进一步证实了它们功能的差异。

讨论

材料和方法

1. 材料：实验所用的多种化学试剂、分子生物学试剂、色谱柱、引物等均购自不同公司，所有试剂均为高质量。
2. 细菌菌株、质粒和细菌生长条件：详细列出实验所用细菌菌株和质粒，以及不同细菌的培养条件，包括培养基、温度、添加的抗生素和诱导剂等。
3. R. solanacearum fabH 缺失菌株的互补实验：通过 PCR 扩增 Xoo 和 Xcc 的 madB 编码序列，构建重组质粒并导入 R. solanacearum fabH 缺失突变体，检测其生长情况。
4. E. coli fabH madA 温度敏感菌株的互补实验：利用携带温度敏感质粒的 E. coli ?fabH?madA/pRP - EcmadA 菌株，导入含有 Xoo 或 Xcc madB 的质粒，在特定条件下筛选能生长的菌株。
5. 蛋白质的表达和纯化：将含有 Xoo 或 Xcc madB 编码序列的质粒转化到 E. coli BL21 (DE3) 中，利用镍离子亲和柱纯化 MadB 蛋白，同时纯化其他相关蛋白。
6. 丙二酸单酰 - ACP 和辛酰 - ACP 的酶促合成：分别利用 Bacillus subtilis 的 Sfp 和 Vibrio harveyi 的 AasS，以特定底物合成丙二酸单酰 - ACP 和辛酰 - ACP，并进行纯化。
7. 3 - 酮酰 - ACP 合酶 III 和丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶活性的体外测定：通过特定反应体系和检测方法，测定 3 - 酮酰 - ACP 合酶 III 和丙二酸单酰 - ACP 脱羧酶的活性。
8. 框内缺失突变体的构建和互补：利用特定方法构建 Xoo 和 Xcc 的 madB 框内缺失突变体，并进行单拷贝互补实验。
9. 脂肪酸组成分析：培养菌株至特定 OD???值，收获细胞处理后，用气相色谱 - 质谱（GC - MS）分析脂肪酸组成。
10. DSF 家族信号的提取和纯化：对 Xoo 和 Xcc 相关菌株进行处理，提取和纯化 DSF 家族信号，并用 HPLC 定量分析。
11. 环境因素对 Xoo 和 Xcc 突变体生长的影响：将菌株培养后，稀释并点种在含有不同环境胁迫因素的平板上，观察生长情况。
12. 膜完整性分析：利用 1 - N - 苯基萘胺（NPN）摄取试验测定细菌膜通透性。
13. 致病性测试：分别在水稻和卷心菜上进行 Xoo 和 Xcc 菌株的致病性测试，测量接种后病斑长度。
14. 游泳和群集运动性测定：在半固体平板上进行细菌的游泳和群集运动性测定。
15. 胞外酶活性和 EPS 产生的测量：通过特定方法测定胞外酶活性和 EPS 产量，包括酶活性的定性和定量分析，以及 EPS 产量的测定和评估。
16. 生物膜形成测定：按照特定步骤进行生物膜形成测定，通过染色和吸光度测量评估生物膜形成情况。
17. 5’RACE 和逆转录 PCR：提取细菌 RNA 并反转录为 cDNA，用于 PCR 扩增和确定转录起始位点。
18. β - 内酰胺酶活性测定：扩增 madB 基因上游片段，构建 β - 内酰胺酶报告载体，导入细菌后测定 β - 内酰胺酶活性。
19. 统计分析：使用 GraphPad Prism 7.0 对实验数据进行方差分析（ANOVA），并进行多重比较。

打赏

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