研究背景

研究结果

1. Delta 感染个体单克隆 nAbs 的分离：研究收集了 6 名 Delta 变异株感染患者的血液样本，这些患者未接种过新冠疫苗。感染初期血浆样本对 Delta 变异株的中和作用弱，康复期则表现出高中和活性，且对 Delta 变异株的中和活性显著高于野生型（WT）变异株，表明 Delta 自然感染诱导了菌株特异性中和抗体反应。而 10 名 WT 感染康复患者的血浆对 WT 的中和作用更强。通过流式细胞术，以 Delta 变异株 S1 蛋白为诱饵分选 Delta S1 特异性单记忆 B 细胞，成功鉴定出 4 种针对 Delta 变异株的单克隆 nAbs，其中 ConD-852 仅与 Delta RBD 结合，不与 WT RBD 反应，是 Delta RBD 特异性单克隆 nAb，且仅能中和携带 L452R 和 T478K 突变的 Delta 变异株及携带 L452R 的 Epsilon 变异株，而对 WT SARS-CoV-2 感染无抑制作用。
2. ConD-852 是 R452 依赖的单克隆 nAb：Kappa 和 Lambda 变异株对 ConD-852 的中和作用具有抗性，进一步分析 L452Q、T478K、E484Q 和 F490S 突变的影响发现，478 位的 T 或 K 不影响 ConD-852 的中和作用，452 位的 L 或 Q 会使其失去中和能力，Kappa 变异株中 E484Q 替代虽不影响 ConD-852 识别 R452，但显著影响其中和活性。竞争 ELISA 显示，ConD-852 与 C144 结合表位重叠，属于 Class 2 nAbs 。
3. ConD-852 的结合亲和力：表面等离子共振（SPR）分析表明，ConD-852 的 IgG 形式与 Delta-S1 和 WT-RBD_L452R具有高亲和力，解离常数分别为 0.35 nM 和 0.17 nM。其 Fab 片段虽亲和力有所下降，但仍对 Delta-S1（11 nM）和 WT-RBD_L452R（13 nM）有一定结合能力，为后续结构测定等研究提供支持。
4. ConD-852 结合 Delta RBD 的结构基础：冷冻电镜（cryo-EM）结构分析显示，ConD-852 Fab 与 Delta RBD 复合物的结构分辨率为 3.28 ?。ConD-852 重链和轻链分别在 RBD 上掩埋 639.3 ?²和 30.2 ?²的表面积，其重链的 5 个互补决定区（CDR）残基与 Delta RBD 上的 5 个表位残基相互作用，而轻链几乎不参与直接相互作用。R452 和 E484 这两个非保守残基可能对 ConD-852 针对不同 SARS-CoV-2 变异株的中和活性有贡献，它们与 ConD-852 重链形成的氢键在发生 R452Q、R452L、E484K 或 E484Q 突变时可能会丢失，这也解释了 ConD-852 对部分变异株中和活性丧失的原因。
5. L452R 突变对 WT SARS-CoV-2 诱导的 mAbs 的影响：对属于 Class 2 的 11 种抗 RBD 单克隆抗体分析发现，C119、C144 和 S2M11 对 WT_D614G_R452 的中和活性几乎不受影响，L452R 突变未对它们产生空间位阻效应；而 P5A-1B9、COV2-2130 等部分单克隆抗体的中和活性则明显降低甚至完全丧失，这表明 L452R 突变导致的空间位阻以及 E484 的位移可能共同影响了单克隆抗体的中和活性。
6. ConD-852 对 R452 残基结合的严格限制：研究检测 ConD-852 对 19 种 452 位单点突变的 SARS-CoV-2 变异株的中和作用，发现 ConD-852 仅能中和 R452 变异株，对其他 452 位突变的变异株无中和作用，显示出其结合模式的严格限制。而 4 种 WT RBD 特异性 nAbs 虽对 L452 变异株的中和活性有所下降，但仍有一定交叉反应性。

研究讨论

研究方法

1. 生物样本：选取 6 名确诊感染 SARS-CoV-2 Delta 变异株的患者，患者未接受疫苗和抗体治疗，采集其血浆和外周血单个核细胞（PBMC）样本，分别储存于 -80°C 和液氮中备用。
2. 假病毒中和试验：通过共转染 HEK-293T 细胞制备假病毒，将稀释的测试样本（血浆或单克隆抗体）与假病毒孵育，再加入 HEK-293T-hACE2 细胞，培养 48 h 后检测荧光素酶活性，计算半数抑制稀释度（ID₅₀）和半数抑制浓度（IC₅₀）。
3. 从 SARS-CoV-2 Delta 感染供体中分离单克隆抗体：用抗体鸡尾酒染色解冻的 PBMCs，以 Delta-S1 为探针分选抗原特异性单细胞，经 RT-PCR 和巢式 PCR 扩增重链和轻链可变区，测序后克隆到表达载体，转染 293 F 细胞表达并纯化单克隆抗体。
4. ELISA：将 SARS-CoV-2 Delta-S1、Delta-RBD 和 WT-RBD 蛋白包被 96 孔板，依次加入稀释的单克隆抗体、HRP 标记的山羊抗人 IgG 抗体，孵育后显色，在 450 nm 波长下检测吸光度。
5. 竞争 ELISA：将 Delta-RBD 或 Delta 刺突蛋白包被 96 孔板，加入稀释的单克隆抗体与 HRP 标记的 ConD-852 混合物，孵育显色后检测吸光度，通过与阴性对照比较确定竞争效应。
6. SPR 结合亲和力分析：使用 Biacore 8 K 系统，将 Delta-S1 或 WT RBD（L452R）固定在 CM5 传感器芯片上，检测抗体与蛋白的结合亲和力，拟合 1:1 结合模型计算亲和力常数。
7. 冷冻电镜样本制备和数据收集：将 Delta 刺突蛋白 RBD 与 ConD-852、P2C-1F11 和 S304 的 Fab 片段孵育后分离纯化，制备冷冻电镜样本，在 Titan Krios 透射电子显微镜上收集数据。
8. 冷冻电镜数据处理和模型构建：对收集的冷冻电镜数据进行处理，包括校正漂移、估计焦散值、挑选粒子、分类和重构等步骤，以 AlphaFold2 预测的模型为初始模型，经手动调整和精修构建原子模型。

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