《Applied Microbiology and Biotechnology》：Characterization of β-glucosidase activity of a Lactiplantibacillus plantarum 6-phospho-β-glucosidase
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为解决现有 β- 葡萄糖苷酶（β -Glucosidases）用于水果产品香气提升时存在的问题，研究人员对来自植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ）NCIM 2903 的 10 种假定糖基水解酶进行克隆和重组表达。结果发现仅 LpBgl5 有 β- 葡萄糖苷酶活性，它可水解芒果中的糖苷结合挥发物（GBV），为水果产品香气提升提供潜在途径。
在水果加工领域，香气是影响产品品质的关键因素之一。β- 葡萄糖苷酶能够水解糖苷结合挥发物（GBV），释放出香气化合物，从而提升水果产品的香气。然而，目前市场上用于提升水果产品香气的商业酶制剂大多并非真正的 β- 葡萄糖苷酶，而是以果胶酶为主，β- 葡萄糖苷酶仅作为次要活性成分。此外，虽然已有许多微生物来源的 β- 葡萄糖苷酶被研究，但多数用于香气提升的酶来自酵母，对于新型细菌来源的 β- 葡萄糖苷酶研究较少。植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）作为一种重要的乳酸菌，具有多种代谢功能，其在水果汁发酵过程中可通过 β- 葡萄糖苷酶活性水解香气糖苷，且基因组中存在多个 β- 葡萄糖苷酶基因。但目前针对植物乳杆菌 β- 葡萄糖苷酶的研究较少，为了深入挖掘其在水果产品香气提升方面的潜力，来自共生国际（被视为大学）共生生物科学学院的研究人员开展了相关研究。
研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过生物信息学分析（in silico analysis）预测了植物乳杆菌 NCIM 2903 基因组中 10 种假定的糖基水解酶，这些酶属于 GH1 家族。接着进行克隆和异源表达，将这些酶的基因克隆到大肠杆菌（E. coli）中进行表达，并利用亲和层析对重组蛋白进行纯化。然后，采用酶活性测定、底物特异性分析等方法对酶的性质进行研究，还通过气相色谱分析评估酶对芒果 GBV 的水解能力。
研究结果如下：
- 生物信息学分析结果：预测的 10 种潜在糖基水解酶基因，经注释为 6 - 磷酸 -β-D - 葡萄糖苷酶或芳基 - 磷酸 -β-D - 葡萄糖苷酶，分子量在 52.7 - 57.8kDa，等电点在 4.87 - 5.64，均属于 GH1 家族，且都不是分泌蛋白。
- 酶的表达与活性：10 种基因在大肠杆菌中成功表达，除 LpBgl2 外，其他重组蛋白均在可溶性部分。在 10 种重组蛋白中，只有 LpBgl5 表现出 β- 葡萄糖苷酶活性。其最适 pH 为 6，最适温度为 40°C。
- 底物特异性：LpBgl5 对不同底物的活性不同，水解 pNPXyl 的能力比 pNPGlc 更强，还能水解部分天然葡萄糖苷，但不能水解纤维二糖，可归类为芳基 -β- 葡萄糖苷酶。
- 动力学参数与特异性活性：LpBgl5 在最高底物浓度下也未出现活性饱和，以 pNPGlc 和 pNPXyl 为底物时，特异性活性分别为0.06Umg?1和0.19Umg?1。
- 化学物质和单糖的影响：金属离子和螯合剂 EDTA 对 LpBgl5 的活性无显著影响，SDS 完全抑制其活性。葡萄糖和木糖可显著刺激其 β- 木糖苷酶和 β- 葡萄糖苷酶活性，且随着糖浓度增加，活性持续增强。但该酶对乙醇耐受性较差。
- 水解芒果 GBV 的能力：LpBgl5 能水解芒果中的 GBV，在体外（ex situ）和体内（in situ）水解实验中，分别释放出 19 种和 6 种挥发性化合物，这些化合物属于单萜类、酚类和降异戊二烯类。
研究结论和讨论部分表明，虽然预测的 10 种糖基水解酶基因注释有所不同，但通过实验确定了 LpBgl5 具有 β- 葡萄糖苷酶活性，且具有独特的底物特异性和对单糖的耐受性，这表明对注释酶进行生化表征对于其实际应用至关重要。LpBgl5 可作为潜在的候选酶，用于从植物基质中释放生物活性化合物和香气化学物质，在开发增值和功能性食品方面具有重要意义。尽管该酶在水解纤维素方面存在局限，但可通过定点诱变等技术进行改进。同时，其氨基酸残基与底物特异性和单糖耐受性的关系，还需进一步的结构表征研究。总的来说，这项研究为水果产品香气提升以及功能性食品开发提供了新的思路和潜在的酶资源。
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