微生物生物膜 “瘦身”,加速铁矿物还原 ——《Geobacter 生物膜胞外电子转移蛋白助力铁矿物还原研究

《Applied and Environmental Microbiology》:Extracellular electron transfer proteins contribute to reduction of ferric minerals by Geobacter biofilms

【字体: 时间:2025年04月10日 来源:Applied and Environmental Microbiology 3.9

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  本文聚焦 Geobacter 生物膜,通过调控胞内双核苷酸第二信使水平构建不同菌株,研究生物膜厚度和胞外电子转移(EET)能力对 Fe (III) 矿物还原的影响。发现薄生物膜还原 Fe (III) 矿物更快,鉴定出两种新 c 型细胞色素参与该过程,为理解微生物 - 矿物相互作用提供新视角。

  ### 研究背景
铁 (III) 羟基氧化物广泛存在于土壤和沉积物中,在缺氧环境下,异化金属还原微生物(DMRMs)可将电子供体的细胞质呼吸氧化反应与胞外含铁 (III) 矿物的还原相偶联,其中 Geobacter spp. 是研究较多的一类。细菌常形成生物膜,在自然环境中,铁氧化物为微生物生长提供电子受体和底物,Geobacter spp. 在铁丰富的栖息地中占据主导地位,对碳和矿物循环至关重要。生物膜形成受细胞内信号网络调控,环二鸟苷酸(c-di-GMP)和环腺苷酸 - 鸟苷酸(cGAMP)等双核苷酸第二信使在调控 Geobacter sulfurreducens 生物膜形成和 EET 中起关键作用。此前研究多集中于电化学系统或浮游细胞,对自然环境条件下生物膜介导的 Fe (III) 还原研究较少。

材料与方法


  1. 细菌菌株和培养条件:实验使用野生型(WT)Geobacter sulfurreducens PCA 菌株及通过电穿孔转入不同质粒构建的 PCA/GMP-L、PCA/GMP-H、PCA/GAMP-H 和 PCA/C 等菌株。所有菌株在厌氧、30°C 条件下,以 20mM 乙酸盐为电子供体、40mM 富马酸为电子受体,在最小培养基(NB)中培养。
  2. 铁矿物的制备和表征:采用先前建立的方法制备水铁矿、针铁矿和纤铁矿,利用 X 射线衍射(XRD)和扫描电子显微镜(SEM)对其晶体结构和形态进行表征,使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定铁含量。
  3. 铁还原动力学:将矿物悬浮液涂覆在玻璃载玻片上,接种 Geobacter sulfurreducens 菌株,在厌氧、30°C 条件下培养。在预定时间间隔,使用邻菲啰啉法测定总 Fe (II) 和总铁浓度,根据伪零级反应模型计算 Fe (III) 还原速率常数。实验结束后,用 XRD 和 SEM 分析次生矿物的形态和组成。
  4. 生物膜图像和生物量测量:采用微孔板法和结晶紫染色法研究生物膜在非导电表面的形成;用荧光核酸染料 SYTO 9 对矿物表面的生物膜染色,通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像;用 NaOH 裂解生物膜细胞,离心后取上清液,使用 Qubit 蛋白检测试剂盒和 Qubit 荧光计测定总蛋白浓度,以确定生物量。
  5. RNA 测序和数据分析:收集水铁矿表面成熟生物膜中的细菌细胞,提取总 RNA,进行质量评估和定量。具体基因表达分析细节见补充材料。
  6. 定量 PCR(qPCR):对 RNA-seq 分析中获得的 c 型细胞色素(c-Cyt)基因差异表达进行 qPCR 验证。
  7. 缺失突变体的构建:按照先前方法构建 Δ1996、Δ2513、Δ2808 和 Δ3615 等基因缺失突变体,通过 PCR 和 DNA 测序验证。

结果


  1. 四种 Geobacter sulfurreducens 菌株在非导电表面的生物膜形成:PCA/GMP-H 菌株在非导电表面形成的生物膜结晶紫染色吸光度高于 PCA/C,而 PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 菌株低于 PCA/C。四菌株在富马酸培养基中的生长无显著差异,表明生物膜生物量差异并非由细胞生长引起。
  2. 四种 Geobacter sulfurreducens 菌株在含铁 (III) 矿物表面的生物膜形成:在含铁 (III) 矿物表面,所有菌株生物膜厚度在接种后 3 - 9 天呈现先增加后下降的趋势。PCA/GMP-H 形成的生物膜较厚,PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 形成的生物膜较薄。生物膜生物量在不同矿物系统中均为 PCA/GMP-L(~PCA/GAMP-H) < PCA/C < PCA/GMP-H,且水铁矿系统中生物膜生物量高于针铁矿和纤铁矿系统。
  3. Geobacter sulfurreducens 生物膜对铁矿物的还原:所有菌株均可还原铁矿物,水铁矿的生物还原量显著高于针铁矿和纤铁矿。PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 形成的较薄生物膜,其 Fe (III) 还原速率在还原水铁矿、针铁矿和纤铁矿时均快于 PCA/C 和 PCA/GMP-H。四菌株在还原不同铁矿物时,产生的次生矿物种类无显著差异。
  4. 工程化 Geobacter sulfurreducens 菌株生物膜细胞的差异基因表达:与 PCA/C 相比,PCA/GMP-H、PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 分别有 1182、866 和 1165 个基因差异表达。PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 中生物膜相关基因表达较低,而 PCA/GMP-H 中较高。同时,PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 中参与 EET 的基因,如编码胞外菌毛蛋白 PilA-N、外膜 c-Cyt 和胞外 c-Cyt 等基因表达上调。
  5. GSU1996 和 GSU2513 参与 Geobacter sulfurreducens 生物膜对含铁 (III) 矿物的还原:删除 gsu1996 或 gsu2513 基因会降低浮游细胞还原水铁矿的能力,且 Δ1996 和 Δ2513 生物膜的 Fe (III) 还原速率显著慢于 WT。将相应基因导入缺失突变体可恢复其还原能力,证实了 GSU1996 和 GSU2513 在铁矿物还原中的关键作用。

讨论


此前研究多在生物电化学系统中以电极作为电子受体研究 Geobacter 生物膜的 EET,难以描述自然系统中 Geobacter 生物膜对含铁 (III) 矿物的还原过程。本研究首次系统探究了 Geobacter sulfurreducens 在含铁 (III) 矿物表面的生物膜形成及其对 Fe (III) 氧化物还原活性的影响。
研究发现,尽管 PCA/GMP-H 形成的生物膜较厚,但在还原铁矿物时与 PCA/C 速率相似,可能是因为 Fe (III) 氧化物的氧化还原电位较低,在较厚生物膜中电子传递存在热力学挑战。而 PCA/GMP-L 和 PCA/GAMP-H 形成的薄生物膜,因 EET 相关蛋白表达上调,生物膜导电性增强,从而具有较高的 Fe (III) 氧化物还原活性。GSU1996 和 GSU2513 在 EET 过程中起重要作用,其缺失会影响浮游细胞和生物膜对铁矿物的还原。
本研究使用含铁 (III) 矿物涂层载玻片模拟自然环境中微生物与铁的相互作用,揭示了薄生物膜中 EET 蛋白水平升高可显著增强 Fe (III) 还原活性。未来进一步研究 Geobacter 生物膜对不同 Fe (III) 氧化物还原的关键电子转移蛋白,将有助于理解 Geobacter 在环境中的竞争力,推动对生物膜介导的 Fe (III) 氧化物还原过程及相关生物地球化学循环的认识。

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