《Applied and Environmental Microbiology》：Genome analysis reveals a biased distribution of virulence and antibiotic resistance genes in the genus Enterococcus and an abundance of safe species
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本文通过分析大量肠球菌（Enterococcus）基因组序列，发现毒力和抗生素抗性基因主要集中在粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium）中，多数其他物种无此类基因，具有用于食品发酵或作益生菌的潜力，值得关注。
肠球菌的多面性及研究背景
肠球菌（Enterococcus）是革兰氏阳性菌属，包含超过 64 个物种。在国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中，存有 40000 多个肠球菌的基因组序列。其中，粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium）在胃肠道中占据主导地位，约占成年微生物群的 1%。
肠球菌不仅是肠道微生物群落的一部分，还广泛存在于富含碳水化合物的环境中，像植物和发酵食品。在乳制品发酵过程中，肠球菌对风味的形成贡献颇大。例如在切达干酪里，它能提高风味强度、加速成熟。而且，肠球菌和其他乳酸菌（LAB）一样，可通过产生乳酸延长发酵食品的保质期，部分还能生成抗菌肽（如肠菌素）抑制有害微生物生长。此外，一些肠球菌具有益生菌特性，能黏附肠道细胞、耐受胃肠道环境，其形成的生物膜有助于保护肠道、减轻炎症并抵御病原体入侵。
不过，肠球菌中部分菌株存在毒力和抗生素抗性问题，严重阻碍了其在食品发酵中的广泛应用。多数相关报道聚焦于粪肠球菌和屎肠球菌，它们的致病菌株可引发多种医院感染，还可能转移抗生素抗性基因。但其实，许多用于食品发酵的其他乳酸菌，如乳杆菌（Lactobacillus）和乳球菌（Lactococcus），也存在类似问题，只是未得到足够重视。在欧盟，欧洲食品安全局（EFSA）规定用于食品的菌株不能含有毒力和可转移的抗生素抗性基因。因此，在将肠球菌应用于食品前，必须对其安全性进行全面评估。
研究材料与方法
为探究肠球菌属中毒力和抗生素抗性基因的分布情况，研究人员从 NCBI 数据库下载了完整的基因组序列。最初获取了 1475 个完整基因组，其中 702 个带有 NCBI 参考序列注释的基因组用于初步评估。但这些序列大多属于粪肠球菌和屎肠球菌，为更好了解其他物种的基因分布，又额外下载了 427 个代表 32 个物种（每个物种在 NCBI 数据库中基因组序列超过 3 个）的基因组序列进行分析，还单独分析了 4 个具有工业和益生菌潜力物种（E. lactis、E. durans、E. hirae、E. mundtii）的基因组序列。所有序列均于 2024 年 9 月获取，利用 CheckM（Galaxy Version 1.2.3 + galaxy0）检查基因组完整性，排除高污染基因组。
在基因组注释和系统发育树构建方面，使用 Prokka（Galaxy Version 1.14.6 + galaxy1）默认设置对基因组进行统一注释，相似性 e 值截止为 1e - 06，采用细菌王国遗传密码 11。通过 Roary（Galaxy V3.13.0）确定核心基因组，BlastP 最小百分比同一性为 95%，基因要纳入核心基因组的分离株百分比为 99% 。利用 Roary 分析的 Newick 输出文件生成泛基因组系统发育树，并通过 iTOL V6 进行可视化和编辑。
研究人员运用 ABRicate mass screening（Galaxy v.1.0.1）和 Resfinder 软件，基于毒力因子数据库，对所有检索到的基因组进行毒力因子和抗菌抗性基因的筛查。ABRicate mass screening 和 Resfinder 均采用默认设置，最小 DNA 同一性百分比为 80%，最小 DNA 覆盖百分比为 80%。
研究结果与讨论
对肠球菌属模式菌株的基因组分析显示，截至 2024 年 9 月，NCBI 数据库中肠球菌的 40172 个全基因组序列里，粪肠球菌和屎肠球菌的序列占比高达 93%，其余 62 个物种仅占 7%。通过基因组系统发育分析，可将 64 个参考物种聚为 6 个不同分支，犬肠球菌（Enterococcus canis）未归入任何分支，表明其可能经历了独特的进化压力。分析还发现，各物种的基因组大小和 GC 含量差异较大，反映出进化的多样化。例如，IV 分支的基因组大小变化范围为 2.0 - 5.4 Mb，是最具多样性的分支之一。
在毒力基因流行情况上，某些粪肠球菌和屎肠球菌分离株携带毒力基因，像 esp、hylEfm、asa1、gelE、cyl 等基因，这些基因在致病过程中发挥着重要作用。但 EFSA 规定，用于动物营养的肠球菌不能含有 IS16、hylEfm 和 esp 等遗传元件。研究人员对 702 个完整注释的肠球菌基因组分析后发现，粪肠球菌的毒力基因普遍多于其他物种，其较长的分支长度暗示了显著的基因变化，可能与宿主适应和毒力基因积累有关。相比之下，在 279 个屎肠球菌基因组中，主要检测到与黏附相关的毒力基因。而在其余 62 个物种的 145 个基因组中，毒力基因数量相对较少，部分基因组甚至不含毒力基因。
进一步分析除粪肠球菌和屎肠球菌外的物种毒力分布时，研究人员发现，从植物或食物中分离出的许多肠球菌物种，如 E. moraviensis、E. aquimarins 等，基因组中完全没有毒力基因。一些物种如 E. lactis、E. durans、E. hirae 的部分基因组虽含有黏附相关基因，但这些基因通常不被视为毒力决定因素。而且，已有研究表明，像 E. lactis、E. durans、E. hirae 和 Enterococcus thailandicus 等缺乏毒力和抗生素抗性基因的物种，具有益生菌潜力，适合作为食品发酵微生物。
在抗生素抗性基因方面，农业中抗生素的过度使用致使肠球菌的抗生素抗性问题日益严重，其中万古霉素抗性备受关注。研究人员通过全基因组分析发现，多数屎肠球菌基因组含有对多种抗生素（如万古霉素、氨基糖苷类、大环内酯 - 林可酰胺 - 链阳菌素 B（MLS）类、四环素）的抗性基因。粪肠球菌基因组则主要含有对 MLS 类抗生素和 lsa (A) 抗性基因，超过半数还含有四环素抗性基因（tetM），部分还同时存在 tetL 基因。
在除粪肠球菌和屎肠球菌外的其他物种中，E. gallinarum、E. casseliflavus 等部分物种的基因组中存在万古霉素抗性基因（vanC），但多数物种不含抗生素抗性基因。例如 E. lactis、E. durans、E. hirae、E. mundtii 等物种，其基因组中抗生素抗性基因的携带情况各异，不过总体抗性基因较少。EFSA 强调要监测和控制用于食品和饲料的益生菌及微生物菌株的抗生素抗性，规定肠球菌对氨苄青霉素的最低抑菌浓度应≤2 mg/L。尽管肠球菌存在水平转移基因的能力，但这并非肠球菌所特有，且部分肠球菌含有 CRISPR - Cas 防御机制基因，可阻碍水平基因转移。
研究结论
肠球菌具有巨大的工业潜力，但因其安全性问题未得到充分开发。研究表明，抗生素抗性和毒力基因主要集中在肠道微生物群中的粪肠球菌和屎肠球菌。除粪肠球菌外，其他物种中除黏附相关基因外，毒力基因较少，而黏附相关基因在多种益生菌和食品源细菌中普遍存在。万古霉素、四环素和氨苄青霉素抗性给肠球菌感染的治疗带来挑战，但此类抗性仅存在于特定物种。研究还发现了多个不含毒力和抗生素抗性基因的物种，它们主要存在于动物肠道以外的环境。因此，若通过基因组和生理特性鉴定确认安全，肠球菌属成员可考虑用于食品发酵。
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