《Microbiology Spectrum 3.7》:Microbial communities on dry natural rocks are richer and less stressed than those on man-made playgrounds
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这篇研究聚焦城市儿童游乐环境微生物群落。通过对比天然岩石和橡胶垫,发现岩石上细菌丰度和丰富度更高,橡胶垫微生物网络更复杂。研究表明人造环境微生物群落较差,为城市规划和公共卫生策略提供依据,助力提升城市微生物多样性。(16S rRNA、ASV、PERMANOVA 等)
研究背景
在城市化进程中,自然植被环境被人造建筑和密封表面取代,如混凝土、沥青和橡胶等。以欧盟为例,城市近一半区域被人造不透水表面覆盖,这些材料干燥快,温湿度变化大。在城市儿童游乐环境中,橡胶垫虽满足安全需求,但从未有人将其微生物群落与自然土壤对比。同时,免疫介导疾病发病率上升,有假说认为这与城市环境中微生物暴露减少有关,其中生物多样性假说提出城市儿童接触环境微生物多样性的机会少于农村儿童,但这一假设尚未得到充分验证。因此,本研究旨在对比城市自然岩石和人造橡胶垫这两种干燥环境的微生物群落,验证生物多样性假说中的相关假设。
材料和方法
- 实验设置与采样:在芬兰拉赫蒂和赫尔辛基,于 2021 年 7 月采集 19 个操场橡胶垫和 9 个天然岩石表面土壤(0 - 3mm)样本,共 28 个。部分样本来自同一采样区域的成对样本。橡胶垫材料为苯乙烯 - 丁二烯橡胶和乙烯 - 丙烯 - 二烯单体橡胶,岩石包括黑云母副片麻岩、微斜长石花岗岩或石英岩。样本采集时天气晴朗或多云,气温超 20°C,气候较干燥。从每个橡胶垫和岩石采集两个灰尘样本,分别来自不同位置,采样后置于冰袋冷藏,当天冷冻至 - 20°C,2 天内保存于 - 80°C,2 个月内提取 DNA 并扩增后测序。
- 定量 PCR(qPCR):使用 SYBR Green I 结合法在 Light Cycler 96 定量实时 PCR 仪上对细菌 16S rRNA 基因进行定量 PCR。反应体系包含多种成分,每个样本重复三次。通过标准曲线定量原始样本中细菌 16S rRNA 基因拷贝数,设置阳性和阴性对照,遵循特定的循环程序和熔解曲线分析参数。
- MiSeq 测序样本制备:采用 Illumina MiSeq 16S rRNA 基因 metabarcoding 技术,读长 2×300bp,v3 试剂试剂盒分析样本细菌群落。样本 DNA 提取使用 PowerSoil DNA Isolation Kit,经琼脂糖凝胶电泳和 Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂定量后,调整浓度至 0.4ng/μL。对 16S rRNA 基因 V4 区域进行 PCR 扩增,设置阴性和阳性对照,PCR 产物纯化后进行二次 PCR(TagPCR)。
- 序列处理:利用 Mothur(1.48.0 版本)处理和分析测序数据。按照 MiSeq 标准操作流程,修剪和筛选序列,去除引物错配、模糊碱基和长于 8bp 的同聚物。将细菌序列与 SILVA 参考序列(132 版本)比对,预聚类减少测序错误,将序列分组为扩增子序列变体(ASVs),用 VSEARCH 算法去除嵌合体,去除叶绿体、线粒体、未知、古菌和真核生物序列,以及低丰度(≤10)的 ASVs。
- 统计分析:使用 R 4.2.2 和 RStudio IDE 进行统计分析。qPCR 结果采用 Mann - Whitney U 检验比较所有样本,配对样本用配对 t 检验。用 cooccur 包进行属水平共现网络分析,计算边和节点数量。用 indicspecies 包进行 ASV 水平指示物种分析。用 vegan 和 phyloseq 包计算不同分类水平的 Shannon 多样性指数和丰富度,数据标准化处理。用多种检验方法比较样本间细菌群落差异,用 PERMANOVA 分析群落组成差异,并用非度量多维缩放(NMDS)可视化,使用 Benjamini - Hochberg 校正控制错误发现率。
结果
- 细菌 16S rRNA 基因拷贝数:天然岩石样本中 16S rRNA 基因拷贝数范围为 8.43×106 - 1.85×107,橡胶垫样本为 8.84×103 - 1.54×107。天然岩石样本平均基因拷贝数高于橡胶垫样本(1.18×107 vs 4.63×106;U 检验 P = 0.001),配对样本差异更显著(1.09×107 vs 2.25×106;配对 t 检验 P < 0.0001)。
- 共现网络分析:橡胶垫上细菌属的边数(41,309)和节点数(644)多于天然岩石(边数 3,506,节点数 397)。橡胶垫上 99.6% 的边为正,天然岩石上为 95.3%。橡胶垫上细菌属形成单一大型网络,天然岩石上除大型网络外还有多个小型网络。
- 指示物种分析:配对样本的 ASV 水平指示物种分析显示,岩石栖息地指示物种(67 个 ASVs)远多于橡胶垫(3 个 ASVs)。岩石样本中典型污垢细菌包括根瘤菌目、β - 变形菌目等多个目,26 个指示 ASVs 属于变形菌门,25 个属于放线菌门。橡胶垫指示 ASVs 属于盖尔菌目、热微菌目和根瘤菌目。
- 丰富度和 Shannon 多样性指数:天然岩石样本平均丰富度(3,111±1,180)高于橡胶垫样本(2,306±1,189),配对样本中岩石样本丰富度(3,178±856)也高于橡胶垫样本(2,578±1,134)。在优势细菌门和纲中,配对样本中放线菌门在天然岩石上丰富度更高(P < 0.0001,Q < 0.0001)。Shannon 多样性指数在不同分类水平下,天然岩石和橡胶垫样本相似,但放线菌门、放线菌纲和嗜热脂肪杆菌纲在天然岩石上有更高多样性的趋势,不过校正后差异不显著。
- 细菌群落组成:PERMANOVA 分析表明,橡胶垫和天然岩石的细菌群落组成(β - 多样性)无差异(P = 0.487,F = 0.940,R2 = 0.035)。但天然岩石样本群落间相似性更高,橡胶垫样本群落更分散。有四个橡胶垫样本(A1、A12、A16 和 A19)形成亚组,其 ASV 数量最低,这些样本来自距离木本植物较远的操场。
讨论
- 微生物群落差异:研究结果支持假设,即天然岩石上微生物群落比橡胶垫更丰富多样。橡胶垫上变形菌门和放线菌门组成较差,可能是因为天然岩石能提供更多生态位。虽然未配对样本中放线菌门丰富度差异不显著,但配对样本中差异显著,可能是未配对样本位点方差大降低了统计效力。
- 共现网络差异:橡胶垫上细菌共现网络更复杂,符合环境干燥增加土壤细菌共现的研究结果。这表明橡胶垫对细菌来说是更具压力的栖息地,细菌通过形成更复杂网络和生物膜来适应恶劣环境。
- 细菌来源和生存:样本中细菌可能来自周围土壤、动植物及人类接触。橡胶垫上细菌基因拷贝数低,可能是其在人造表面存活率低,受水、空气供应、材料孔隙度和化学成分影响。橡胶垫上细菌基因拷贝数与某些土壤相当,但远低于北方森林和农业土壤。
- 绿色空间的影响:虽橡胶垫和天然岩石样本 β - 多样性无差异,但天然岩石样本 β - 多样性更均一。四个特殊橡胶垫样本来自无木本植物的操场,暗示木本植物组成的绿色空间可能改善橡胶垫对地面微生物群落的影响。
- 微生物与健康:岩石样本中大量指示 ASVs 属于变形菌门和放线菌门,与健康相关。变形菌门在人体皮肤有免疫调节功能,可预防过敏和特应性皮炎;放线菌门在皮肤低 prevalence 与皮肤疾病有关。橡胶垫指示 ASVs 属于适应极端环境的类群,说明其缺乏天然干燥环境的微观生态位。
- 研究局限性和展望:本研究为生物多样性假说提供了初步证据,但样本仅来自芬兰两个城市,存在样本量限制。后续应在多个气候区和地理区域采样,研究共享分类群模式。尽管有局限性,但研究结果仍警示橡胶垫不利于城市微生物多样性,应重视保护和恢复城市土壤微生物丰富度。
结论
本研究表明,与芬兰最干燥的天然栖息地天然岩石相比,操场橡胶垫无法支持丰富的微生物群落。两种干燥栖息地灰尘和污垢微生物组存在明显差异,且与健康相关。由于本研究未测试免疫反应和共生微生物群,鼓励开展更多暴露研究。橡胶虽在建筑环境中广泛应用,但从支持城市微生物多样性角度看并非最佳选择,研究支持人造城市环境微生物群落不丰富的假设,这对地球健康具有重要意义。
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