ABSTRACT
人类口腔微生物组是细菌物种进化占据特定生态位的复杂系统。奈瑟菌科（Neisseriaceae）包含Neisseria、Eikenella、Kingella和Simonsiella等属，在共生与致病关系中发挥重要作用。本研究采用宏泛基因组方法，通过竞争性映射揭示K. oralis、N. elongata和N. mucosa主要定植于牙菌斑，N. subflava偏好舌背，而N. cinerea富集于角化牙龈。功能分析显示牙菌斑特化菌种具有氮代谢（硝酸盐还原/反硝化）、赖氨酸降解和半乳糖代谢等通路优势；舌背特化菌则表现出氨基酸生物合成、短链脂肪酸转运和脂多糖糖基化等特征性适应机制。

INTRODUCTION
口腔作为生物群落包含舌、颊黏膜、牙齿表面（龈上/龈下）、牙龈等多重微环境。奈瑟菌科作为呼吸道和黏膜表面常见菌群，其硝酸盐还原能力和黏附素介导的定植机制尤为突出。尽管已知致病菌如N. meningitidis（脑膜炎）和N. gonorrhoeae（淋病），但更多共生菌种（如N. bacilliformis、N. lactamica等）的生态位适应机制尚不明确。本研究聚焦四个功能相近的属，通过整合泛基因组学与宏基因组学解析其空间分布与遗传基础。

MATERIALS AND METHODS
研究从NCBI获取3,937个RefSeq基因组，经质量筛选（完整度>90%，污染<5%）和去冗余（ANI<98%）获得213个高质量参考基因组。使用Anvi'o（v.8）构建泛基因组，通过Prodigal预测开放阅读框，COG20、KEGG（v.97）等功能数据库注释基因。采用HMP项目的1,297个口腔宏基因组样本（含颊黏膜、龈上菌斑等9个位点），经bowtie2竞争性映射和50%覆盖度阈值筛选，结合代谢通路富集分析（q<0.01）鉴定生态位特异性基因。

RESULTS

1. 泛基因组与系统发育
   泛基因组分析显示N. subflava和N. mucosa存在显著亚群分化，而N. polysaccharea与7个新命名菌种形成独立分支。值得注意的是，口腔共生菌N. cinerea与致病菌N. meningitidis/N. gonorrhoeae聚为一支，暗示潜在进化关联。Simonsiella muelleri在系统发育上嵌套于Kingella属，提示分类学修订需求。

2. 生态位分布特征
   宏基因组映射揭示：牙菌斑中K. oralis、N. elongata和N. mucosa共存但呈现互斥分布模式；舌背样本中N. subflava单菌种占比高达82%；角化牙龈则几乎被N. cinerea独占。特别发现N. mucosa亚群中仅部分携带硝酸盐还原酶操纵子（NarGHIJ），而该功能主要由N. oralis和N. elongata执行。

3. 功能适应性
   牙菌斑特化菌显著富集：

• 氮代谢：完整反硝化通路（M00529）及钼辅因子（MoCo）合成基因
• 碳源利用：D-赖氨酸代谢（RacX）和半乳糖-Leloir途径（M00632）
• 环境应激：铜抗性蛋白（CutA/CutF）和超氧化物歧化酶（SodC）

舌背特化菌N. subflava独有：

• 氨基酸合成：组氨酸/鸟氨酸/脯氨酸通路（M00026/M00028/M00015）
• 膜修饰：脂多糖糖基化酶（RfaJ）和甘油转运体（GlpF）

角化牙龈菌群功能保守，仅检测到Na+/H+二羧酸同向转运体（GltP）的特异性富集。

DISCUSSION
研究首次系统揭示奈瑟菌科通过代谢网络重构实现口腔生态位分区：牙菌斑菌群通过硝酸盐还原（NarGHIJ）和多元碳源利用建立竞争优势；舌背菌则依赖氨基酸自主合成应对营养限制；而角化牙龈菌可能通过高效底物摄取适应特殊微环境。值得注意的是，MafB毒素基因在N. mucosa中的特异性分布，或解释其与N. elongata/K. oralis的互斥现象。这些发现为理解口腔菌群定植规律提供了分子框架，并为针对性地调控致病菌-共生菌平衡开辟新思路。

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