在肿瘤的发展过程中，缺氧和细胞衰老都起着关键作用。缺氧是实体肿瘤的固有特征，由肿瘤细胞增殖与血管营养供应失衡导致，它在肿瘤血管生成、细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用，但具体的调控机制尚不清楚。细胞衰老则是细胞正常生理功能和增殖能力随时间或外界压力逐渐下降，导致不可逆或持续性细胞周期停滞的过程。已有研究发现，缺氧和衰老之间存在潜在联系，二者可能共同促进癌症的发生发展，然而，缺氧诱导的衰老在 HCC 中的预后作用仍不明确。

为了深入探究这一问题，厦门大学附属中山医院等机构的研究人员开展了相关研究。他们通过整合生物信息学、机器学习和实验验证等多种方法，对缺氧衰老共相关基因（Hypoxia-senescence co-related genes，HSCRGs）在 HCC 中的分子亚型和预后特征进行了系统分析。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 HCC 的临床风险分层和个性化治疗提供了新的思路和依据。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先，从公共数据库收集数据，包括来自 TCGA、GEO 和 ICGC 的 mRNA 表达数据及临床信息等。然后，通过 Venn 图筛选出 184 个 HSCRGs。运用随机森林算法筛选疾病特征基因，利用 LASSO 回归和单、多变量 COX 回归构建预后风险模型，并在多个队列中进行验证。此外，还借助单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析肿瘤细胞异质性，使用基因富集分析（GO 和 KEGG）探索基因功能和信号通路。

在研究结果方面，研究人员首先对 HSCRGs 进行了深入分析。通过对 1603 个缺氧相关基因和 308 个衰老相关基因的交集分析，确定了 184 个 HSCRGs。这些基因存在广泛的拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV），其中超过半数的 HSCRGs 出现拷贝数增加。进一步分析发现，20 个基因在癌组织中显著上调，通过单变量 COX 和相关性分析，确定了 16 个风险因子和 3 个保护因子，它们与 HCC 预后显著相关。

接着，研究人员对疾病特征基因进行了筛选和验证。利用随机森林算法分析发现，MLH1 基因对疾病的影响最为重要。生存分析显示，高表达 MLH1 的 HCC 患者生存率显著更低。qPCR 和 Western blot 等实验验证了 MLH1 在肝癌细胞系中高表达，在正常肝细胞中低表达。功能实验表明，敲低 MLH1 可显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡，提示 MLH1 可能是 HCC 中的癌基因。

随后，研究人员基于 HSCRGs 对患者进行聚类分析。利用 R 包 “ConsensusClusterPlus” 进行聚类，发现了两种缺氧和衰老相关的表型，即 HSCRGs-clusters A 和 B。PCA 分析验证了聚类的有效性。其中，HSCRGs-cluster A 患者生存预后较好，HSCRGs-cluster B 患者生存预后较差。进一步分析发现，HSCRGs-cluster B 中免疫细胞浸润更为丰富，且与氨基酸代谢、生物活性物质代谢等生物学过程相关；而 HSCRGs-cluster A 则与细胞器组织的正调控和致病性大肠杆菌感染信号通路等相关。

研究人员还进行了二次聚类和预后模型构建。通过对不同 HSCRGs 亚型间差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）的分析，共鉴定出 831 个 DEGs，并将患者分为三个基因簇亚型。生存分析表明，基因簇 C 患者预后最差，基因簇 A 患者预后最好。通过单变量 COX 分析、LASSO 分析和多变量 COX 分析，构建了由七个关键预后基因组成的预后风险模型，计算出风险评分（Risk Score，RS）。结果显示，RS 可作为独立的预后预测指标。

在风险模型的开发和验证中，研究人员将样本分为训练队列和测试队列，并使用 ICGC-LIRI-JP 队列进行外部验证。结果表明，高风险组患者生存率和无进展生存期（Progression-Free Survival，PFS）均显著低于低风险组。ROC 曲线和校准曲线显示，该风险模型和列线图在预测 HCC 患者生存方面具有良好的性能，且优于其他临床特征。

研究人员还对两个风险组的肿瘤免疫微环境等进行了分析。CIBERSORT 和 ssGSEA 分析发现，低风险组中静息 CD4?记忆 T 细胞和巨噬细胞 M1 浸润水平较高，免疫功能更强，免疫检查点表达水平也更高；而高风险组中激活的 CD4?记忆 T 细胞、单核细胞和中性粒细胞浸润水平较高。此外，高风险组与染色体着丝粒区域、细胞周期等功能注释相关，低风险组则与氨基酸和脂肪酸代谢等功能注释相关。

最后，通过单细胞分析，研究人员对肿瘤微环境中的细胞亚群和关键基因表达模式进行了解析。共鉴定出 11 个细胞簇，分为肿瘤细胞、T 细胞、巨噬细胞和 NK 细胞 4 种类型。分析发现，7 个关键预后基因在不同细胞类型中呈现不同的表达模式，且肿瘤细胞在细胞通讯网络中起主要信号转导作用，关键基因在 SPP1 和 MK 信号通路中富集。

在研究结论与讨论部分，研究人员通过筛选 184 个 HSCRGs，揭示了两种不同的共表达簇，它们在免疫浸润方面存在显著差异。HSCRGs-cluster B 的不良预后可能与其免疫抑制特性有关。该研究首次整合 HSCRGs 构建预后风险模型，全面考虑了缺氧和衰老的相互作用，为 HCC 的研究提供了新视角。外部验证和列线图的良好性能，进一步证明了该模型的可靠性和临床实用性。同时，研究发现 MLH1 在 HCC 中高表达且可能是癌基因，为 HCC 治疗提供了新靶点。此外，通过单细胞分析，深入了解了关键预后基因在肿瘤微环境中的作用。然而，该研究也存在一定局限性，如未结合临床样本进一步验证，相关分子机制尚未完全阐明等。未来研究可进一步探索 HSCRGs 作为诊断标志物和治疗靶点的潜力，以及药物再利用和维生素等预防措施对 HCC 的影响。

总的来说，该研究成功构建了 HCC 的预后风险模型，确定了与肿瘤发生和免疫细胞浸润相关的关键基因，为 HCC 的风险分层和个性化治疗提供了重要依据，对推动 HCC 的基础研究和临床治疗发展具有重要意义。