《Cell & Bioscience》：The RBM39 degrader indisulam inhibits acute megakaryoblastic leukemia by altering the alternative splicing of ZMYND8
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急性巨核细胞白血病（AMKL）治疗缺乏个性化方案，研究人员开展了关于 RBM39 抑制剂 indisulam 治疗 AMKL 的研究。结果发现 indisulam 能抑制 AMKL 细胞生长，诱导细胞周期停滞和凋亡，该研究为 AMKL 治疗提供了新方向。
急性巨核细胞白血病（AMKL）是一种罕见的血液恶性肿瘤，在儿童和成人中均有发生，且 5 年生存率显著低于其他急性髓系白血病（AML）亚型 。尽管治疗手段不断进步，如强化治疗方案和异基因造血干细胞移植，但目前仍缺乏针对 AMKL 的个性化治疗方法，这使得寻找新的治疗策略迫在眉睫。
为了解决这一难题，苏州大学附属儿童医院等机构的研究人员开展了一项关于 AMKL 治疗的研究。他们聚焦于靶向剪接因子 RNA 结合基序蛋白 39（RBM39）的分子胶降解剂 indisulam，探究其在 AMKL 模型中的治疗效果。研究发现，indisulam 能够有效抑制 AMKL 细胞的生长，诱导细胞周期停滞和凋亡，显著降低白血病负担并延长 AMKL 小鼠的生存期。这一研究成果发表在《Cell & Bioscience》上，为 AMKL 的治疗提供了新的潜在方向。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：细胞实验，包括细胞培养、细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）检测细胞活力、软琼脂集落形成实验检测细胞增殖和侵袭能力；基因编辑技术，如利用短发夹 RNA（shRNA）敲低基因表达、CRISPR-Cas9 系统敲除 DCAF15 基因；分子生物学技术，包括实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测 mRNA 表达水平、RNA 测序（RNA-seq）分析可变剪接事件、蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白表达；动物实验，构建 AMKL 小鼠模型，进行体内成像和组织学分析。
研究结果如下：
- indisulam 有效抑制 AMKL 细胞存活：公共药物敏感性数据分析显示，AMKL 细胞系对 indisulam 的敏感性高于其他肿瘤类型。indisulam 处理 AMKL 细胞后，细胞活力下降，凋亡细胞比例增加，细胞周期发生改变，G1 期细胞减少，G2 期细胞增多。同时，indisulam 诱导 RBM39 蛋白降解，导致经典凋亡蛋白聚 ADP - 核糖聚合酶（PARP）裂解，c-MYC 和细胞周期蛋白依赖性激酶 4（CDK4）表达降低。
- 敲低 RBM39 重现 indisulam 的作用：通过 DEMETER2 平台分析发现，RBM39 在 AMKL 细胞生存中起着不可或缺的作用。RBM39 在 AMKL 细胞系中高表达，shRNA 介导的 RBM39 表达敲低显著降低细胞增殖率，促进细胞凋亡，干扰细胞周期进程，并诱导 PARP 裂解，降低 c-MYC 和 CDK4 表达。
- RBM39 敲低延缓 AMKL 体内发展：将 CMK - luciferase - shNC 细胞（阴性对照组）或 CMK - luciferase - shRBM39 细胞（敲低组）静脉注射到 NSG 小鼠体内，敲低组小鼠的白血病负担显著降低，总体生存期明显延长。
- RBM39 降解导致 AMKL 细胞可变剪接缺陷：indisulam 处理 AMKL 细胞后，RBM39 蛋白几乎完全降解，转录组分析显示可变剪接事件增加，包括外显子跳跃（SE）和内含子保留（RI）事件。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，受影响的基因富集在泛素介导的蛋白水解和细胞周期通路。以 EZH2 基因为例，indisulam 处理导致其在 14 号外显子发生 SE 事件，蛋白表达减少。
- ZMYND8 是 AMKL 细胞中 RBM39 的下游靶标：综合 RNA-seq 和蛋白质组学分析，研究人员鉴定出 22 个关键基因发生多种类型的可变剪接事件，其中 ZMYND8 在 indisulam 处理或 RBM39 敲低后出现显著的剪接失调，蛋白水平降低。ZMYND8 在 AML 患者中高表达，且与不良预后相关，敲低 ZMYND8 抑制 AMKL 细胞生长，诱导细胞凋亡。
- indisulam 的抗 AMKL 作用依赖于 DCAF15：DCAF15 在 AMKL（M7）中的表达水平高于其他 AML 亚型。CRISPR/Cas9 系统敲除 DCAF15 后，indisulam 对 AMKL 细胞的细胞毒性显著降低，无法诱导 ZMYND8 和 EZH2 的可变剪接，也不能诱导 RBM39 降解，相关蛋白表达未发生改变。
- indisulam 在体内抑制肿瘤生长：构建 AMKL 小鼠模型，分为 DCAF15WT + vehicle、DCAF15WT + indisulam 和 DCAF15KO + indisulam 三组。生物成像显示，indisulam 有效降低 DCAF15WT组小鼠的肿瘤负担，而在 DCAF15KO组中未观察到该效果。DCAF15WT + indisulam 组小鼠的 Ki67 和人 CD45 阳性细胞数量显著低于其他组，总体生存期更长，且未观察到明显的药物毒性。
研究结论和讨论部分指出，本研究证明了 indisulam 在体外和体内均具有显著的抗 AMKL 活性。indisulam 通过降解 RBM39 诱导 ZMYND8 的异常剪接，导致 AMKL 细胞周期停滞和凋亡。鉴于 indisulam 在其他肿瘤类型的 II 期临床试验中耐受性良好，本研究为 AMKL 患者提供了潜在的治疗选择，值得进一步开展临床试验进行验证。同时，DCAF15 的表达水平可作为预测 indisulam 治疗敏感性的生物标志物，有助于精准筛选适合接受 indisulam 治疗的 AMKL 患者。然而，本研究也存在一些局限性，如未测试 ZMYND8 特定剪接产物的功能，未充分研究其他基因的剪接事件及其在 AMKL 生存中的作用，且缺乏 AMKL 临床样本。未来需要进一步研究来克服这些局限性，推动 AMKL 治疗的发展。
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